不同產地半夏指紋圖譜的建立及化學模式識別研究*

魏淑婕，張蒙蒙，賈曉華，歐陽慧子，李天祥，何俊

（1.天津中醫藥大學，組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381）

半夏來源于天南星科多年生草本植物半夏Pinelliaternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖，辛、溫，有毒，歸脾、胃、肺經[1]，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結等功效[2]。半夏作為中藥材始見于《五十二病方》，后在《傷寒雜病論》中被廣泛使用。目前，因其具有抗腫瘤、降低血脂及抗新型冠狀病毒感染等藥理作用而備受關注，成為臨床常用藥材之一[3-4]。隨著市場需求量不斷增加，而半夏野生資源匱乏，存在市場缺口，人工栽培成為其替代途徑，但人工栽培過程中存在栽培技術滯后、品種選育研究薄弱等問題[5]，導致市售半夏質量參差不齊、來源復雜，給臨床用藥帶來諸多不便。如何利用現代分析方法控制半夏質量，是半夏藥材研究進展中亟待解決的問題。

中藥所含化學成分多樣復雜，單一或幾個成分不能全面反映藥材質量[6]，指紋圖譜能夠在整體層面表征藥材化學成分，是一種綜合、可量化的鑒別與評價手段[7-9]。化學模式識別技術可對中藥指紋圖譜信息進行深度挖掘，反映中藥的內在成分差異，對其質量控制具有重要意義[10-12]。因此，本研究采用超高效液相色譜（UPLC）法建立半夏藥材指紋圖譜，并運用SPSS 和SIMCA 軟件進行化學模式識別分析，以期為半夏質量研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 UPLC 色譜儀（美國Agilent公司）；Milli-Q IQ 7005 超純水制備儀（Millipore 公司）；5424R 型高速控溫離心機（德國Eppendorf 公司）；AS60/220.R2 型十萬分之一天平（波蘭Radwag 公司）；G3KT18273 型旋渦混合器（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試藥 對照品：胞苷（批號：DST190314-087）、次黃嘌呤（批號：DST190407-087）、尿苷（批號：DST190108-024）、肌苷（批號：DST180521-028）、鳥苷（批號：DST190311-045）、腺苷（批號：2-ALI-112-1）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；磷酸（色譜級）購自美國ROE 公司；乙腈（色譜級）購自美國Fisher 公司；超純水由Milli-Q 超純水制備儀制備。

1.3 藥材 半夏藥材采自不同產區，樣品去除泥沙與雜質，干燥，粉碎備用。具體樣品信息見表1，經天津中醫藥大學李天祥教授鑒定為天南星科植物半夏Pinelliaternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖。

表1 半夏藥材樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：A 相0.1%磷酸水，B 相乙腈；梯度洗脫，洗脫梯度為：0～5 min，1%～5%B；5～9 min，5%～14%B；9～10 min，14%～20%B；10～14 min，20%～45%B；流速：0.2 mL/min；進樣體積：10 μL；柱溫：32°C；檢測波長：260 nm。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取胞苷、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷對照品各5.0 mg，加水溶解，配制成1 mg/mL 的對照品溶液，置于4 ℃冰箱儲存備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取半夏粉末（過4 號篩）1.0 g 置于10 mL 錐形瓶中，加水溶解定容至刻度線處，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）提取30 min后取出，放至室溫再次稱取質量，補足失去的質量，用0.22 μm 濾膜過濾取續濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度實驗 取半夏樣品（S9）粉末，精密稱定1.0 g，按照“2.3”項下的制備方法制備供試品溶液，在“2.1”項的色譜條件下連續進樣6 次，計算得到各共有峰保留時間RSD 均小于0.1%，峰面積RSD 小于1.7%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性實驗 取半夏樣品（S9）粉末，精密稱定1.0 g，按照“2.3”項下的制備方法，平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項的色譜條件下進樣，計算得到各共有峰保留時間RSD 小于1.5%，峰面積RSD小于5.9%，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性實驗 取半夏樣品（S9）粉末，精密稱定1.0 g，按照“2.3”項下的制備方法制備供試品溶液，并在“2.1”項的色譜條件下分別于0、2、6、8、12、24 h 進樣分析，計算得到各共有峰保留時間RSD 小于0.6%，峰面積RSD 小于6.6%，表明樣品在24 h內穩定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立 分別稱定18 批半夏樣品各1.0 g，按照“2.3”項下的制備方法制備供試品溶液，并在“2.1”項的色譜條件下進樣分析，得到UPLC 指紋圖譜。將色譜圖數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723 版本）”，生成18 批供試品色譜圖，其中共標定15 個共有峰，通過對照品比對指認出6 個色譜峰，分別為胞苷（3 號峰）、次黃嘌呤（4 號峰）、尿苷（6 號峰）、肌苷（7 號峰）、鳥苷（10 號峰）、腺苷（12 號峰），供試品色譜圖及混合對照品圖譜見圖1。

圖1 供試品及混合對照品指紋圖譜

2.6 相似度評價 設置S1 為參照圖譜，采用平均數法，時間窗寬度為0.1，通過多點校正后進行整體相似度評價，相似度評價結果見表2。16 批不同產地半夏藥材相似度均大于0.877，其余2 批樣品指紋圖譜與對照圖譜相比相似度較低，其中S12（山西省運城市新絳縣）相似度為0.606，S16（河北省石家莊市鹿泉區）相似度為0.778。結果表明，大部分產地半夏樣品指紋圖譜的一致性較高，只有2 批樣品差異較大。

表2 18 批半夏樣品相似度評價結果

2.7 化學模式識別分析

2.7.1 聚類分析 以18 批不同產地半夏藥材的15 個共有峰面積為原始數據，經標準化處理后，導入SPSS 23.0 軟件，進行聚類分析。以平方歐式距離為測度，采用組間連接法，結果見圖2。當類間距離為10 時，18 批樣品被分為兩組，其中S1～S11、S13～S15、S18 聚為一類，S12、S16 聚為一類。

圖2 18 批半夏樣品的聚類分析樹狀圖

2.7.2 主成分分析 將18 批半夏藥材的UPLC 指紋圖譜在260 nm 波長下的15 個共有峰峰面積進行標準化處理后，導入SIMCA 14.1 軟件，構建18×15 的原始數據矩陣，Par 作為標度化方式，進行主成分分析。從15 個變量中提取出3 個變量，累計方差貢獻率為82.57%，表明該模型的預測能力良好[13]，提取前3 個主成分繪制PCA 得分圖，結果見圖3。由圖3 可知，S1～S11、S13～S15、S18 聚為一類，S12、S16 聚為一類，與聚類分析結果一致。

圖3 18 批半夏樣品主成分分析得分圖

主成分分析載荷圖中的點代表各共有峰，距離原點（0，0）越遠，表明其權重越大，對樣品質量差異影響越大[14]，見圖4。由圖4 可知，3 號峰（胞苷）、4 號峰（次黃嘌呤）、5 號峰、8 號峰、10 號峰（鳥苷）、12 號峰（腺苷）、13 號峰和15 號峰是不同批次產生差異的主要原因，表明造成S12、S16 與其他批次產生差異是上述多種成分協同作用的結果。

圖4 18 批半夏樣品主成分分析載荷圖

2.7.3 正交偏最小二乘法-判別分析 為了進一步分析不同批次半夏樣品的批間差異性，采用SIMCA 14.1 軟件在聚類分析和主成分分析的基礎上對數據進行正交偏最小二乘-判別分析。正交偏最小二乘-判別分析得分見圖5，結果可見18 批樣品被較好地分為兩類。在建立的分析模型中，結實率參數R2X為0.691，區分參數R2Y為0.927，預測參數Q2為0.789，均大于0.5，說明模型穩定性和預測準確性良好[15]。

圖5 18 批半夏樣品正交偏最小二乘-判別分析得分圖

隨機改變分布變量Y的排列順序200 次進行置換檢驗，得到置換檢驗圖6，R2回歸線在Y 軸截距為0.217，Q2回歸線在Y 軸截距為-0.553，說明所建立的模型不存在過擬合現象，可用于判別分析18 批樣品的批間差異[16]。

圖6 正交偏最小二乘-判別分析模型的置換檢驗結果（n＝200）

正交偏最小二乘-判別分析模型中變量重要性投影值（VIP 值）可直觀反映出各變量對樣品分類的貢獻值，篩選VIP 值＞1.0 的變量為差異性標志成分[17]，結果見圖7。通過對照品指認，具有統計學意義的6 個差異性標志成分的貢獻程度依次為3 號峰（胞苷）＞5 號峰＞4 號峰（次黃嘌呤）＞15 號峰＞10 號峰（鳥苷）＞8 號峰，上述成分是S12、S16 樣品與其他批次樣品之間產生差異的主要原因。在S12、S16 樣品中，3 號峰、4 號峰、5 號峰和15 號峰的峰面積均大于其他批次樣品，而10 號峰的峰面積均小于其他批次樣品。該結果與主成分分析中載荷圖的分析結果基本一致。

圖7 18 批半夏樣品正交偏最小二乘-判別分析各成分VIP 圖（±s）

3 討論

本研究考察了不同提取溶劑（水、70%甲醇、30%甲醇）、色譜柱類型（CORTECS C18柱、ACQUITY UPLC HSS T3 柱）、流動相種類（乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-水、乙腈-水）及不同檢測波長（210、254、260 nm）條件下樣品分析時間、色譜峰峰形、峰數及峰響應的情況，確定采用ACQUITY UPLC HSS T3 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），以乙腈-0.1%磷酸水為流動相，在260 nm 檢測波長下進行分析，所得色譜峰峰形良好，分析時間短。構建了半夏藥材UPLC 指紋圖譜，并對18 批不同產地樣品進行分析。共標定15 個共有峰，其中指認6 個色譜峰，分別為胞苷、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷及腺苷。相似度結果顯示16 批樣品相似度均大于0.877，其余2 批分別為0.606、0.778。

聚類分析和主成分分析結果一致，大部分批次的樣品具有較高一致性，只有2 批樣品與其他樣品的差異較大。通過正交偏最小二乘-判別分析模型中的VIP 值共篩選出6 個差異性標志成分（經對照品比對指認出其中3 種成分為胞苷、次黃嘌呤、鳥苷），是造成S12（山西省運城市新絳縣）、S16（河北省石家莊市鹿泉區）與其他批次產生差異的主要原因。胞苷、次黃嘌呤、鳥苷所屬的核苷類成分作為半夏中主要的一類成分，已被證實是半夏“降逆止嘔”的主要物質基礎[18]。現代研究表明核苷類成分參與DNA 代謝過程，具有抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性[19]。陳衛等[20]在不同炮制方法對半夏的差異性影響研究中發現，胸苷、次黃嘌呤和尿嘧啶的含量差異較為顯著，可作為半夏不同炮制品有效區分的特征成分。王翠翠等[18]在對半夏及其混偽品的研究中發現，依據尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷4 種核苷的含量可以很好地區分半夏、水半夏和虎掌南星。此外，徐文英[19]對比了不同品種半夏中鳥苷和腺苷的含量，發現在不同品種半夏樣品中兩種成分的含量存在明顯差異，認為核苷類成分對于評價半夏質量具有重要意義。本研究結果與上述研究結果較為一致，胞苷、次黃嘌呤、鳥苷的含量可以反映出不同產地半夏樣品的差異性，且其所屬的核苷類成分為半夏的主要藥效物質，因此在對半夏的質量研究中應重點關注胞苷、次黃嘌呤、鳥苷等成分的含量變化。

本研究建立了半夏藥材的UPLC 指紋圖譜，結合聚類分析、主成分分析等化學模式識別方法進行綜合分析，并采用正交偏最小二乘-判別分析篩選出不同產地半夏的差異性標志成分，可為半夏質量評價研究和資源開發利用提供參考。