冬凌草甲素對雨蛙素誘導的重癥急性胰腺炎大鼠免疫紊亂和組織損傷的影響*

方萍，鄧雪麗，杜芳芳，彭琦，張莉

（1.荊州市中醫醫院普外科，荊州 434002；2.荊州市中醫醫院手術室，荊州 434002；3.荊州市中醫醫院骨科，荊州 434002；4.湖北民族大學附屬民大醫院普外科，恩施 445000）

重癥急性胰腺炎屬于急性胰腺炎的特殊類型，占全部急性胰腺炎的10%～20%，是一種炎癥性疾病且病情復雜多變、并發癥多、病死率高，其發病機制與胰酶活性、細胞凋亡因子失訪和炎性細胞因子等密切相關[1-2]。重癥急性胰腺炎發生時，胰腺內的消化酶被異常活化導致大量的炎性細胞因子分泌，引起胰腺組織發生炎性反應、水腫、細胞死亡、免疫紊亂和組織損傷等[3-4]。重癥急性胰腺炎胰腺組織分泌的炎性因子會進一步引起肝損傷、肺損傷等并發癥[5]。冬凌草甲素（Ori）是冬凌草的主要活性成分，屬于二萜類化合物，在抗炎癥、抗細胞凋亡、抗氧化、血管生成、免疫調節、細胞自噬等多種生物學活性中起作用[6-8]。Xu 等[9]研究發現，Ori 可以抑制胰腺癌BxPC-3 細胞增殖，下調炎性因子白細胞介素-1β（IL-1β）表達，但Ori 在重癥急性胰腺炎中的作用研究鮮見報道。因此，本研究通過建立重癥急性胰腺炎大鼠模型，圍繞Ori 對重癥急性胰腺炎模型大鼠胰腺組織免疫功能紊亂和組織損傷的影響進行研究，探討Ori 對重癥急性胰腺炎大鼠組織損傷和免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD 雄性大鼠（5 周齡，體質量120～150 g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-009，使用許可證號：SYXK（京）2017-0022。實驗動物嚴格遵守“3R”原則，并通過荊州市中醫醫院倫理委員會批準，每只大鼠給予24 h 晝夜燈光照射控制及嚴格、規范的卡片登記管理，24 ℃條件下封閉群養。

1.1.2 實驗試劑 Ori（純度≥98%）購自四川維克奇生物技術有限公司（CAS：28957-04-2）；酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、免疫組化染色試劑盒、3，3’-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色試劑盒購自美國Sigma 公司；羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）-免疫球蛋白G（IgG）（ab6728）、兔抗單克隆抗體B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）相關X 蛋白（Bax）（ab104156）、兔抗單克隆抗體Bcl-2（ab194583）、兔抗單克隆抗體GAPDH（ab22555）購自英國Abcam 公司。

1.1.3 主要實驗器材 普通光學顯微鏡（Eclipse E100，日本奧林巴斯公司），電子天平（YP201N，上海天平儀器廠），酶標儀（RT-6100，Rayto），-80 ℃冰箱（902-ULTS，美國Thermo 公司），臺式高速離心機（D3024R，DRAGONLAB），聚合酶鏈反應（PCR）儀（冬勝龍ETC811，北京東勝創新生物科技有限公司），電泳儀（Powerpace Basic，美國Bio-rad 公司），轉膜儀（The Trans-Blot Turbo，美國Bio-rad 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥 將SD 雄性大鼠隨機分為5 組，分別為對照組（Control）、大鼠重癥急性胰腺炎組（SAP）、SAP+Ori 5 mg/kg 組（SAP+Ori 5 mg/kg）、SAP+Ori 10 mg/kg 組（SAP+Ori 10 mg/kg）、SAP+Ori 20 mg/kg 組（SAP+Ori 20 mg/kg）。采用4%水合氯醛0.1 mL/10 g 麻醉大鼠，SAP 和各給藥組SD 大鼠皮下注射雨蛙素（25 μg/kg）誘導大鼠急性胰腺炎，采用化學誘導法建立重癥急性胰腺炎大鼠模型[10]，大鼠出現胰腺水腫，胰腺與體質量比值、血清脂肪酶和淀粉酶升高表示造模成功。本實驗造模成功率為80%，造模成功后2 h 內，各給藥組分別口服5、10、20 mg/kg 的Ori[9]，Control 和SAP 喂食生理鹽水，1 h內測定各組大鼠胰腺功能指標，測定完成后頸椎脫臼法處死大鼠進行后續實驗。

1.2.2 樣本采集 建模成功后2 h，各組取10 只大鼠，稱取大鼠體質量，頸椎脫臼法處死大鼠并取出胰腺組織，稱取胰腺組織質量，計算胰腺質量指數（胰腺質量指數=胰腺質量÷體質量×100%），眼眶取血用于測定脂肪酶和淀粉酶水平。胰腺組織用于實時定量熒光PCR（RT-PCR） 和蛋白免疫印記（Western Blot）法檢測，其余組織用福爾馬林固定，石蠟包埋，用于HE 染色和免疫組化檢測。

1.2.3 ELISA 法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、白細胞介素-10（IL-10）含量水平 將各組大鼠眼眶靜脈血3 000 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm）后取上清液，重復3 次，按照ELISA 試劑盒操作說明測定血清脂肪酶和淀粉酶以及TNF-α、iNOS、IL-10 的表達水平。

1.2.4 HE 染色觀察胰腺組織病理損傷情況 將各組大鼠胰腺石蠟組織切片后，行HE 染色，光鏡下拍照并觀察記錄組織形態學變化，按照Kusske 評分標準[11]和Schmidt 評分標準進行評分。Kusske 評分內容為：1）水腫。0 分為無水腫；1 分為小葉間區域水腫；2 分為彌漫小葉間水腫；3 分為腺泡腫脹，小葉間隙增寬；4 分為明顯小葉分割。2）炎癥。0 分為無炎癥；1 分為腺管邊緣感染；2 分為實質感染＜50%；3 分為實質感染50%～75%；4 分為塊狀聚集，膿腫。3）出血。0 分為無出血；1 分為實質出血＜25%；2 分為實質出血25%～50%；3 分為實質出血51%～75%；4 分為實質出血＞75%。4）壞死。0 分為無壞死；1 分為腺管周圍實質壞死；2 分為點狀實質壞死＜20%；3 分為小葉缺失20%～50%；4 分為小葉缺失＞50%。Schmidt 評分按水腫、腺泡細胞壞死、出血、炎癥細胞浸潤病理變化的不同程度分為0、0.5、1.0、1.5 分4 個檔次，其總分作為胰腺損傷評分。

1.2.5 免疫組化檢測凋亡細胞 胰腺組織切片脫蠟，放入檸檬酸抗原修復緩沖液（pH=6.0）中進行修復15 min，加入山羊血清封閉液封閉30 min，加入提前配好的一抗[半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）多克隆抗體1：500]孵育過夜，加入二抗，室溫孵育50 min[陰性對照組用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）代替]，DAB 顯色，蘇木素復染3 min，二甲苯透明處理，中性樹膠封片，顯微鏡下檢測，采集圖片，分析陽性細胞率（顯微鏡下陽性細胞為棕黃色）。

1.2.6 Western Blot 法檢測凋亡蛋白Bax/Bcl-2 水平 將胰腺組織用1×PBS 液沖洗去除血液和其他組織（沖洗3 次），用手術剪于冰上將組織剪成小塊并加入提前配制好的2 mL 蛋白裂解液{含7 mol/L尿素、2 mol/L 硫脲、5 mL/L IPG Buffer、65 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）、40 g/L 尿素-3-[（3-膽酰胺丙基）-乙二胺]-1-丙磺酸（CHAPS）、5 mg/L 蛋白酶抑制劑、10 mL/L 胰酶抑制劑}充分混勻后，在冰上用超聲粉碎，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min（離心半徑10 cm），取上清。用二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒測定胰腺組織蛋白濃度，每孔上樣20 μg，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳、轉模、脫脂奶粉封閉，加入一抗，4 ℃孵育搖床過夜。回收一抗，加入按比例稀釋HRP 標記的對應二抗，室溫孵育120 min。采用電化學發光（ECL）法進行化學發光，于暗室下曝光顯影（GADPH 作為內參）。將膠片進行掃描存檔，Photoshop 整理去色，Alpha 軟件分享光密度值。

1.2.7 RT-PCR 法檢測IL-1β、白細胞介素-4（IL-4）mRNA 水平 取新鮮凍存的大鼠胰腺組織50 mg，用PBS 沖洗3 次，眼科手術剪剪成小塊，加入1 mL Trizol 試劑混勻，用電動勻漿機勻漿后，轉移至1.5 mL 無RNA 酶的離心管中，使細胞充分裂解。加入200 μL 三氯甲烷充分混勻后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），棄上清。沿離心管管壁緩慢加入75%乙醇1 mL。4 ℃、7 500 r/min 離心5 min（離心半徑10 cm）后棄上清。待室溫干燥完成后，加入預冷的焦碳酸二乙酯（DEPC）水50 μL 溶解沉淀并立即置于冰上。用1 μL DEPC 水稀釋200 倍后，測定RNA 濃度值。按逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，按RT-PCR 試劑盒操作說明配制反應體系。按試劑盒操作說明加入反應液，待反應完成后放入PCR 儀中進行RT-PCR 反應（PCR反應條件：95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40 個循環），以目的基因和GADPH 比值表示mRNA 表達水平，采用2-ΔΔCt法分析結果。引物由上海生工生物工程有限公司設計合成，IL-1β 上游序列為5’-GGCTTCCTTGTGCAAGTGTC-3’，下游序列為5’-TGTCGAGATGCTGCT-GTGAG-3’；IL-4 上游序列為5’-TACAGCCACCATGAGAAGGAC-3’，下游序列為5’-TGATCGTCTTTAGCCTTTCCA-3’；GAPDH上游序列為5’-GACCTGACCTGCCGT-CTA-3’，下游序列為5’-AGGAGTGGGTGCGCTGT-3’。

1.3 統計學分析 使用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析，所有實驗均有3 份且在不同時間進行3 次重復實驗，取其平均值。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，若滿足方差齊性，兩兩比較采用LSD 法；若方差不齊，兩兩比較采用Dunnettt法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ori 對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺功能和血清炎性因子水平的影響 與Control 比較，SAP 大鼠胰腺與體質量比值、血清脂肪酶和淀粉酶均明顯增加（P＜0.05），證明造模成功。與SAP 比較，經5 mg/kg Ori 給藥治療后，大鼠胰腺與體質量比值、血清脂肪酶和淀粉酶無明顯變化，10、25 mg/kg Ori 治療后顯著降低（P＜0.05）。ELISA 法檢測血清中TNF-α、iNOS、IL-10 蛋白含量，與Control 比較，SAP 大鼠TNF-α、iNOS、IL-10 高表達（P＜0.05）；與SAP 比較，5 mg/kg Ori 治療后大鼠血清中TNF-α、iNOS、IL-10蛋白含量無明顯差異，經10、20 mg/kg Ori 治療后，大鼠血清中TNF-α、iNOS 蛋白含量顯著下調，IL-10蛋白含量上調（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Ori 對重癥急性胰腺炎模型大鼠胰腺功能的影響（±s，n=10）

2.2 Ori 對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織病理損傷的影響 大鼠胰腺組織切片行HE 染色，顯微鏡下觀察胰腺組織形態并行胰腺組織學Kusske 評分和胰腺病變Schmidt 評分。結果發現，Control 大鼠的胰腺組織形態基本正常。與Control 比較，SAP 大鼠具有胰腺組織水腫、炎癥細胞浸潤、細胞壞死等損傷，Kusske 和Schmidt 評分明顯高于Control（P＜0.05）；與SAP 比較，5 mg/kg Ori 給藥治療后，大鼠胰腺損傷和Kusske、Schmidt 評分無明顯差異，10、20 mg/kg Ori 大鼠的胰腺組織水腫、炎癥細胞浸潤、細胞壞死等損傷均有緩解，且Kusske 評分顯著低于SAP（P＜0.05）。結果提示，Ori 能夠改善重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織病理損傷。見圖2。

圖2 大鼠胰腺組織HE 染色（×400）及Kusske、Schmidt 評分結果（±s，n=10）

2.3 Ori 對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織細胞凋亡的影響 免疫組化結果顯示，與Control 比較，SAP大鼠胰腺組織中凋亡細胞數量明顯增多（棕黃色或褐色）；與SAP 比較，經5 mg/kg Ori 給藥治療后，凋亡細胞數量無明顯差異，10、20 mg/kg Ori 治療后大鼠凋亡細胞數量顯著降低。見圖3。

圖3 大鼠胰腺組織免疫組化染色結果（×400）

2.4 Ori 對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織凋亡蛋白水平的影響 與Control 比較，SAP 大鼠Bax 蛋白高表達且Bcl-2 蛋白低表達；與SAP 比較，經5 mg/kg Ori 治療后，Bax、Bcl-2 蛋白表達水平無明顯變化，10、20 mg/kg Ori 顯著下調Bax 蛋白表達并上調Bcl-2 蛋白表達，見圖4A。與Control 比較，SAP 大鼠胰腺組織細胞凋亡數量明顯升高（P＜0.05）；與SAP比較，5 mg/kg Ori 無明顯調節作用，10、20 mg/kg Ori能顯著抑制胰腺組織細胞凋亡（P＜0.05），見圖4B。結果表明，Ori 能夠抑制重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織細胞凋亡，緩解因凋亡引起的組織損傷。

圖4 Ori 抑制重癥急性胰腺炎模型大鼠細胞凋亡蛋白表達情況（±s，n=10）

2.5 Ori 對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織免疫調節因子水平的影響 與Control 比較，SAP 大鼠IL-1β、IL-4 mRNA 水平高表達（P＜0.05）；與SAP 比較，5 mg/kg Ori 治療后無明顯變化，10、20 mg/kg Ori 治療后顯著抑制IL-1β mRNA 表達（P＜0.05），促進IL-4 mRNA 表達（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見圖5。結果進一步提示，Ori 促進免疫調節因子和抗炎因子表達，緩解重癥急性胰腺炎引起的免疫失調和組織損傷。

圖5 胰腺組織IL-1β、IL-4 mRNA 表達水平（±s，n=3）

3 討論

重癥急性胰腺炎是比較常見的一種炎癥性疾病，主要表現為胰腺出血和壞死，炎癥反應加劇伴隨全身性多器官功能失調，故致死率居高不下[12]。重癥急性胰腺炎因并發癥多、病因復雜，導致藥物研發困難，目前國內外尚無特效治療藥物，因此，探尋有效的治療藥物迫在眉睫[13]。Ori 是冬凌草的主要活性成分，具有多種生物學活性。研究表明，Ori 在糖尿病腎病、心肌損傷、急性腎損傷和骨關節炎等疾病中起到調節作用[14-15]。胰腺與體質量比值、血清脂肪酶和淀粉酶水平可以作為急性胰腺炎的診斷指標[16]，也能從側面反映胰腺組織的功能。本研究發現經Ori 治療后，大鼠胰腺組織中血清脂肪酶和淀粉酶的表達均下調，表明Ori 對胰腺功能具有調節作用，HE 染色結果進一步表明Ori 具有改善胰腺組織功能的作用。

細胞凋亡和細胞壞死在重癥急性胰腺炎發病過程中起到重要作用，Caspase-3、Bax 和Bcl-2 是細胞凋亡的標志性因子。Caspase-3 和Bax 在細胞凋亡過程中發揮誘導作用，促進凋亡發生過程進展，引導細胞走向凋亡，加劇組織損傷和組織功能障礙。Bcl-2 則與之相反，在細胞凋亡過程中具有抑制作用[17]。本研究發現，10、20 mg/kg Ori 能夠顯著上調Bcl-2 蛋白表達，下調Caspase-3 和Bax 蛋白表達，結果提示，Ori 能夠抑制胰腺組織細胞凋亡水平，保護重癥急性胰腺炎模型大鼠因細胞凋亡引起的組織損傷和免疫紊亂。

氧化應激引起的炎癥反應誘導胰腺組織發生重癥急性胰腺炎，TNF-α 和iNOS 是重要的炎癥介導因子，iNOS 誘導機體產生大量的活性氧（ROS），促使機體遭受因氧化應激反應引起的組織損傷，IL-10作為抗炎因子，能夠抑制組織炎性活動并下調TNF-α和iNOS 誘導的炎癥反應[18-19]。本研究中Western Blot 法檢測結果發現，經Ori 治療后，重癥急性胰腺炎模型大鼠胰腺組織血清中TNF-α 和iNOS 蛋白表達明顯降低，IL-10 蛋白表達顯著增加，說明Ori在重癥急性胰腺炎模型大鼠炎癥反應中起到抑制作用，緩解因炎癥反應引起的組織損傷。炎癥反應通過干擾機體穩定的免疫系統，致使組織損傷、免疫系統紊亂，相反免疫系統紊亂又會進一步導致炎癥反應加劇，促使機體產生惡性循環。IL-1β 和IL-4是重要的免疫系統調控因子，在正常機體免疫系統中，兩者相互調節，保護機體免受外來感染源的入侵，這種平衡一旦被打破，機體的免疫系統就會出現失調，促使炎癥反應等多種病理性因素擾亂機體正常功能，從而出現組織損傷、細胞壞死等[20-21]。本研究檢測了IL-1β 和IL-4 在胰腺組織中的mRNA表達水平，結果發現，IL-1β 在SAP 大鼠中高表達，但經Ori 治療后，IL-1β 的表達水平被明顯下調，同時IL-4 的表達被上調，說明Ori 能夠通過調節免疫相關因子表達，起到保護大鼠免受因重癥急性胰腺炎引起的免疫系統紊亂和組織損傷作用。

綜上所述，Ori 能夠通過調控凋亡蛋白、炎癥因子和免疫調節因子表達水平，減輕重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織細胞凋亡、炎癥反應和免疫紊亂，緩解胰腺組織損傷。