利用單細胞藻類探究不同色光對光合作用的影響
——以微囊藻與小球藻為例

施欣彤 姜鍶濠 章熙東 譚嘯

(1.南京外國語學校 江蘇南京 210008)

(2.河海大學環境學院潛水湖泊綜合治理與資源開發教育部重點實驗室 江蘇南京 210024)

光合作用是植物最基本的生命活動,是獲得能量和釋放氧氣的重要途徑,是地球上最重要的合成代謝之一,在蘇教版高中生物學《必修1·分子與細胞》模塊中占據重要地位,也是教學中的重難點。 《普通高中生物學課程標準(2017 年版)》明確,為了讓學生更好地理解和掌握教學內容,教學中要高度重視學生的實踐環節,力求為學生提供更多的動手實踐機會。 因此,為幫助學生達成對“細胞的生存需要能量和營養物質,并通過分裂進行增殖”大概念的理解,促進學生生物學學科核心素養的提升,教師應開展“探究不同環境因素對光合作用的影響”的教學活動。 蘇教版新教材必修1 提供了利用天竺葵為實驗材料,探究“不同光質的單色光對植物光合作用的影響”的開放式實驗,為學生提供了很好的學科實踐機會。 但在教學中發現,以不同光質的光(用藍色、紅色、綠色玻璃紙遮光)為自變量,以光合產物淀粉含量為因變量開展實驗,操作過程中對無關變量(如光照強度、溫度)的控制較難,而且用碘液來鑒定淀粉,無法進行定量分析,使該實驗的教學效果受到很大影響。 因此,教師可利用單細胞藻類如銅綠微囊藻(常見藍藻)、小球藻(常見綠藻)為實驗材料,用LED 燈管提供不同色光,以細胞濃度增加(細胞增殖)、藻類光合活性的變化(葉綠素熒光)為因變量,利用光照培養箱培養藻類以控制無關變量,利用葉綠素熒光技術對熒光參數進行定量分析,使實驗的過程更具科學性,能很好地讓學生進行定量研究的學科實踐,有利于培養學生的創新精神和問題解決能力。

1 實驗背景

銅綠微囊藻是常見的水華藍藻,是原核藻類,蛋白核小球藻為常見綠藻,是真核單細胞藻類,二者在細胞結構、色素組成及光利用率上差異明顯,常常在湖泊中共存或競爭生長。 自然水體中的有色可溶物、懸浮顆粒物及水分子等會選擇性吸收不同波長的光,使得不同水域的水下光譜存在差異。 同時,深度也是水下光譜的影響因子之一,如隨著水深的增加,藍綠波段的光快速衰減使得紅光所占的比例迅速增大。因此,探究不同色光對微囊藻和小球藻生長和光合活性的影響,利于讓學生了解“富營養化水體中大量繁殖的藍藻抑制了包括綠藻在內其他藻類的生長,造成了嚴重的水生態安全問題”,利于引導學生從水下光譜變化的角度深度思考藍藻優勢確立的原因,進而培養水環境保護意識。

光合活性表征的是藻細胞光合系統在一定條件下的狀態,受到科學家普遍關注。 葉綠素熒光,作為光合作用研究的重要指標,包含了許多光合信息,幾乎所有光合作用過程的變化均可通過葉綠素熒光反映出來。 藻類細胞的光合活性通常可用葉綠素熒光表征,經過暗適應的藻細胞在低強度測量光條件下會發出初始熒光F0,經過飽和脈沖高光強后發出最大熒光Fm(Fm為最大熒光,進而計算最大可變熒光Fv=Fm-F0)。Fv/Fm表征的是暗適應下PSⅡ(光系統Ⅱ)反應中心完全開放時的最大光合速率,常作為表達藻類光合活性是否受損的敏感性指標。 通常當藻類受到脅迫時,葉綠體中的光系統Ⅱ是首先而且也是主要損害的部位。 熒光測定技術可以不傷害生物體進行活體分析,因此通過研究葉綠素熒光來間接研究光合作用的變化是一種簡便、快捷、可靠的方法。

2 實驗方法

2.1 藻種

蛋白核小球藻與銅綠微囊藻(FACHB-469),均購自中國科學院水生生物研究所的淡水藻種庫。

2.2 培養方法

將微囊藻與小球藻在光照培養箱中用BG11 培養基進行培養,溫度設定為25±1 ℃,光暗周期比為12 h ∶12 h。 將藻種培養至對數期再進行無菌接種,初始接種濃度為5×104cells/mL。 共設置紅光組、藍光組和白光組。 紅光或藍光處理分別由LED 單色燈獲得,通過改變光源距離培養錐形瓶的位置,分別調節紅光組、藍光組和白光組的光強,使各組光強均為45 μm·mol/(m2·s)。 藻種活化9 天后接種,進行正式實驗,每個色光處理設置3 個平行,每天定時搖動錐形瓶3 次。

2.3 指標測定方法

2.3.1 藻細胞濃度測定

采用血球計數板每3 天對微囊藻培養液中藻細胞濃度計數,具體步驟如下:取潔凈的血球計數板一塊,在計數區上蓋上一塊蓋玻片。 將藻懸液搖勻(在藻細胞生長后期,濃度較高的時期進行適當的稀釋),用滴管吸取少許,從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣滴入藻懸液。 將血球計數板放置于顯微鏡的載物臺上夾穩,先在低倍鏡下找到計數區后,再轉換高倍鏡觀察并計數。 計數區由25 個中方格組成,數左上、左下、右上、右下及中央1 個大方格的藻細胞數(即80 個小格)。

每個樣品重復計數3 次(每次數值誤差不超過10%,否則應重新操作),按公式計算出每mL 藻液所含細胞數量。 藻細胞濃度計算公式如下:

C=5N×104×n

式中:

C—1 mL 藻液中含有的藻細胞個數,cells/mL;

N—80 個小方格中細胞總數;

n—稀釋倍數。

2.3.2 光合活性測定

取2 mL 藻液,暗適應20 min,采用葉綠素熒光儀(AquaPen-C AP-C100)測定藻細胞葉綠素a 熒光,測得參數最大熒光(Fm)、最小熒光(F0)、可變熒光強度Fv(即Fm-F0)、PSⅡ原初光能轉換效率(Fv/F0)、PSⅡ的潛在活性(Fv/Fm)。

3 結果與討論

3.1 不同色光對藻類生長的影響

銅綠微囊藻屬于水華藍藻,而蛋白核小球藻為常見綠藻。 由于藍藻與綠藻細胞內色素組成存在差異,因而兩者在可見光(400—800 nm)的吸收光譜有較大差異。 兩種藻的光合系統均含有葉綠素a,440 nm 和680 nm 為葉綠素a 的特征吸收峰。 它們之間的差異色素為各自的捕光色素,微囊藻的捕光色素為藻膽素(以藻藍素為主,特征吸收峰為620 nm),且不含葉綠素b 和葉綠素c,使得它能夠利用紅橙色波段(600—650 nm)的可見光。 而小球藻含有的葉綠素b 可以吸收藍光波段(450—550 nm)的可見光。

細胞內色素的種類決定了藻類的吸收光譜,使其在與捕光色素吸收光譜相似的色光下生長更具優勢。研究發現,微囊藻在紅光下出現最大細胞濃度(2.3×107cells/mL),小球藻的在藍光下出現最大細胞濃度(1.4×107cells/mL)(圖1)。

圖1 不同色光下微囊藻(a)和小球藻(b)的生長曲線

3.2 不同色光對藻類光合活性的影響

本研究采用葉綠素熒光及JIP test 進一步分析光質對光系統Ⅱ能量傳遞的影響。 經過充分暗適應的藻細胞受到光激發(20—50 μs)處于初始相O相,此時PSⅡ反應中心處于完全開放的狀態,測得初始熒光(F0)。 O—J 反映了光合作用的光化學階段,當反應結束,所有反應中心處于關閉狀態,不再接受光量子時,此時達到最大的熒光產量(Fm),P 相出現。 OJIP 曲線記錄了從F0到Fm的整個變化過程,且通過JIP 測定(JIP test)可表征PSⅡ反應中心、電子供體側和電子受體側的具體生理狀態(表1)。

經紅光、藍光和白光培養24 天后,微囊藻與小球藻的葉綠素a 快速熒光曲線如圖2 所示。 微囊藻和小球藻在不同色光下光合系統Ⅱ都出現變化,色光明顯影響P 點相對最大熒光值。 其中藍光和紅光對微囊藻的相對最大熒光值有促進作用,并且藍光的促進作用更明顯。 而對于小球藻,紅光表現促進作用,而藍光表現出抑制作用。

圖2 不同色光下微囊藻(a)和小球藻(b)的OJIP 曲線

作為光系統Ⅱ重要的部分,光合反應中心既從捕光天線(供體側)接受電子還原QA變成Q-A,然后再還原為QA傳遞電子到受體側。 本研究選取ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC、DIo/RC 幾個參數來反映單位光合反應中心的能量傳遞情況(圖3)。

圖3 不同色光下微囊藻(a)和小球藻的(b)JIP-test參數(與白光組對照)

結果表明,在紅光和藍光下培養小球藻,有利于其反應中心的還原作用和電子傳遞,但兩種色光的影響作用差異較小,而紅光和藍光對微囊藻的這兩個過程幾乎沒有影響。 色光對微囊藻和小球藻反應中心的影響差異主要在于捕光色素吸收的能量和耗散能量。 以反應中心為單位,相比于白光,紅光和藍光下培養的微囊藻的ABS/RC 均顯著降低,表明其捕光復合體被抑制。 相反,小球藻在藍光和紅光下捕光復合體被促進,說明經過不同色光處理后,藻細胞的捕光復合體會因為光適應增大或者減小。 這些變化還可能與捕光復合體在光系統Ⅰ和光系統Ⅱ之間的遷移有關。 研究顯示,綠藻中Chl a/Chl b 復合體在光系統Ⅰ和光系統Ⅱ之間的遷移影響了捕光復合體,而在藍藻中也存在著類似的PBS/Chl a 遷移。

Fv/Fm 能夠表征反應中心內的光能轉化效率,反映藻細胞潛在的光合能力。 本研究發現,兩種藻的潛在光合作用能力并沒有在生長較好的色光下出現最大值,反而表現為在生長較慢的色光下更強。 結合OJIP曲線與生長曲線,在實驗末期,藍光下微囊藻細胞濃度最低,但潛在光合作用能力(Fv/Fm)更強(圖3a)。 相反,紅光下小球藻細胞濃度最低,但其潛在光合作用能力更強(圖3b),但是兩者光合作用能量的積累仍受到捕光色素吸收能量的限制,且此時質體醌數量和活性的改變也不利于QA接受供體側電子被還原,實際初始熒光速率仍表現為在兩種藻適宜生長的色光下更大。

4 實驗結論

本研究探究了色光對銅綠微囊藻與蛋白核小球藻生長的影響。 實驗結果發現色光會顯著影響藻類生長和光合效率。 紅光有利于銅綠微囊藻的生長,藍光有利于蛋白核小球藻的生長。 且在共培養體系,微囊藻在紅光下獲勝,小球藻在藍光下獲勝。 葉綠素熒光和OJIP 結果表明,色光對藻細胞光合系統Ⅱ中的捕光色素及電子受體具有顯著影響,色光影響捕光色素復合體的大小、質體醌數量和活性。

5 教學反思

基于真實情境的問題解決更有利于培養學生的生物學科核心素養,源于教材但高于教材的探究活動兼具知識學習、能力培養和素養發展等教學功能。 本實驗結合學生有關富營養化和藻華等生活認知經驗,采用藻類熒光儀等現代測量技術手段進行學科實踐,突破了學習難點,同時加深了學生對科學、技術、社會相互關系的認識。 教師教學時要組織好觀察、實驗等探究性學習活動,幫助學生增加感性認識,克服對微觀結構認識的困難,使學生領悟科學研究的方法并習得相關的操作技能。 讓探究活動沿著“實踐、認識、再實踐、再認識”的螺旋上升式軌跡走向深處,用問題啟發思考,用“已知”探索“未知”,并在創造性解決問題中豐富相關學習經歷。 讓中學生物學課堂浸潤科學的氣息、充滿科學的味道是素養時代下每個教師努力的方向。