二肽激肽酶4抑制劑對帕金森病模型細胞形態和增殖的干預作用及其機制

伊木然江·蘇布哈提，艾尼瓦爾·吾買爾，木塔力甫·艾買提

1 新疆醫科大學藥學院藥理學教研室，烏魯木齊 830017；2 新疆醫科大學中心實驗室

帕金森病（PD）是一種慢性進行性神經退行性疾病，與年齡相關，可被定義為環境因素與遺傳易感性相互作用的多因素疾病［1］。多項研究顯示，PD 及其他神經退行性疾病與2 型糖尿病（T2DM）之間存在一定程度的相關性［2］。T2DM 在細胞代謝、神經元活力及神經行為等方面對神經細胞產生影響，其病理生理機制包括胰島素抵抗、氧化應激、線粒體功能障礙、神經炎癥和蛋白質折疊異常等，可導致神經元細胞功能障礙或死亡，從而觸發PD等神經退行性病變［3-4］。二肽激肽酶4（DPP-4）抑制劑是一種新型抗糖尿病藥物，能夠通過抑制體內DPP-4 酶的活性增強腸促胰島素效應，進而促進胰島β 細胞分泌胰島素和抑制胰島α細胞分泌胰高血糖素來達到降低血糖的目的。目前，DPP-4 抑制劑西格列汀、利格列汀、維格列汀、沙格列汀及阿格列汀等已在我國上市并列入醫保藥品目錄［5-6］。管雅文等［7］研究顯示，在原有治療方案基礎上給予T2DM 合并PD 患者利格列汀治療24 周可明顯改善患者的運動功能。現有研究大多對某一個DPP-4抑制劑對神經系統的保護作用進行探討，而DPP-4抑制劑改善PD 的作用機制及潛在治療靶點等問題尚未明確。2021 年8 月—2023年2月，本研究通過體外實驗結合網絡藥理學，初步探討了DPP-4 抑制劑對PD 的干預作用及其相關機制，以期為DPP-4抑制劑在PD 治療中的應用提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 DPP-4抑制劑對PD體外模型的干預作用觀察

1.1.1 主要材料 神經細胞株PC-12 購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。DMEM高糖培養基、馬血清和特級胎牛血清均購自以色列Biological Industries，胰蛋白酶購自美國Gibco，DMSO 購自美國Sigma，魚藤酮（ROT）購自美國MedChemExpress，二氧化碳培養箱、生物安全柜及酶標儀均購自美國Thermo Fisher Scientific，電熱恒溫水槽購自上海一恒，倒置顯微鏡購自日本Nikon，低溫高速離心機購自美國Sigma。

1.1.2 細胞培養及分組 PC-12 細胞置于含10%胎牛血清、5%馬血清、100 U/mL青霉素及100 g/mL鏈霉素的DMEM 高糖培養基中培養，待細胞進入對數增長期后，以5×103/孔接種到96孔板中，在CO2培養箱（37 ℃、5% CO2、飽和濕度）中常規培養16～18 h。將細胞分為對照組、模型組、模型+西格列汀組、模型+利格列汀組、模型+維格列汀組。

1.1.3 PD 體外模型建立及藥物干預處理 待細胞貼壁后，去掉原培養基，除對照組外各組均使用ROT 建立PD 體外模型。結合前期預實驗結果及參考文獻報道，選擇0.2 μmol/L 的ROT 作為PD 模型的造模濃度。模型組加入含0.2 μmol/L ROT 的完全培養基，模型+西格列汀組、模型+利格列汀組、模型+維格列汀組同時加入含0.2 μmol/L 的 ROT 及20 μmol/L 的西格列汀、5 μmol/L 的利格列汀、10 μmol/L的維格列汀含藥培養基培養24 h，對照組常規培養不做任何處理。

1.1.4 細胞形態學觀察 去除處理24 h 后的各組細胞原培養液，用37 ℃提前預熱的PBS 輕輕沖洗2～3 次，利用倒置顯微鏡觀察各組細胞間的形態差異，并拍照記錄。

1.1.5 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8 法。各組細胞處理24 h后，去掉原含藥培養液，每孔加入200 μL新鮮培養基，在避光條件下每孔加入20 μL的CCK-8試劑溶液，繼續在培養箱中孵育2 h 后，用酶標儀檢測各組在450 nm處的吸光度（A）值。計算各組細胞存活率，以此表示細胞增殖能力。細胞存活率=目的組A值/對照組A值×100%。

1.2 DPP-4抑制劑作用于PD的機制分析

1.2.1 DPP-4 抑制劑作用于PD 的相關靶點收集利用Swiss Target Prediction、SEA、Super-Pred 及PharmMapper 等數據庫分別獲取DPP-4 抑制劑西格列汀、利格列汀、維格列汀、沙格列汀及阿格列汀的藥物靶點，在“Select Species”中選擇“Homo Sapiens”，下載人源靶點，并將5 種藥物靶點信息利用UniProt 數據庫進行標準化處理、合并去重復等操作后得到藥物作用靶點。以“Parkinson's Disease”為疾病關鍵詞，通過DisGeNet、OMIM 和GeneCards 等數據庫獲得PD 相關的疾病靶點。通過UniProt 數據庫將疾病靶點名轉換為相對應的基因名稱，合并去重后最終得到PD 相關的疾病靶點。最后將篩選得到的5 種DPP-4 抑制劑治療靶點和PD 疾病靶點輸入到韋恩圖制作平臺，比對取交集后得到DPP-4 抑制劑治療PD的潛在作用靶點。將每個藥物與PD的交集靶點再取交集，得到DPP-4抑制劑作用于PD 的相關靶點。

1.2.2 DPP-4 抑制劑作用于PD 關鍵靶點篩選 將DPP-4 抑制劑作用于PD 的相關靶點輸入到String 數據庫中，生物種類選定為“Homo sapiens”構建蛋白—蛋白相互作用（PPI）網絡。然后將其.TSV格式文件導入到Cytoscape 3.7.2軟件中，利用NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析，選取基因滿足度（Degree）值＞平均值的基因作為DPP-4 抑制劑對PD 產生作用的關鍵靶點。

1.2.3 DPP-4 抑制劑作用于PD 的關鍵靶點GO 基因功能與KEGG 作用通路分析 將DPP-4 抑制劑作用于PD 的關鍵靶點基因輸入到DAVID 數據庫中，限定物種為“Homo Sapiens”，得到GO 基因功能和KEGG 作用通路分析結果。從GO 基因功能分析P＜0.05 的數據中按Count 值大小排序，選擇前15 的數據；從KEGG 通路分析P＜0.05 的數據中選擇最相關的20個通路進行分析，數據結果采用微生信數據平臺進行可視化。

1.2.4 DPP-4抑制劑作用于PD的核心靶點篩選分別將DPP-4 抑制劑治療PD 的關鍵靶點以及KEGG 信號通路導入到Cytoscape 3.7.2 軟件，構建“藥物—疾病—靶點—通路”網絡，篩選與PD相關信號通路關系最為密切的靶點作為DPP-4抑制劑治療PD的核心靶點。

1.2.5 DPP-4 抑制劑與核心靶點的分子對接驗證 為了初步預測和研究目標蛋白和配體在分子水平上的關系，采用CB-Dock 2 對接平臺進行分子對接實驗。首先將核心靶點的UniProt ID 輸入到AlphaFold 蛋白質結構數據庫下載靶點蛋白的PDB格式文件。利用PubChem 數據庫下載5 種DPP-4 抑制劑3D結構的SDF格式文件，將藥物和核心靶點的文件上傳到CB-Dock 2 數據庫中獲取對接結果。CB-Dock 2可以自動識別目標蛋白質的結合位點、計算中心位置、制定對接盒尺寸，并使用對接程序AutoDock Vina進行對接。

1.3 統計學方法 采用Graphpad Prisim 9.0 統計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk 法行正態性檢驗，呈正態分布以-x±s表示，多組間比較行單因素方差分析，兩組間比較行獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞形態學比較 對照組細胞形態完整，增長狀態良好，細胞呈多角形，細胞之間類似突觸樣連接且突觸較長；模型組細胞密度減少，細胞皺縮，細胞與細胞間的突觸樣連接斷裂，且觀察到較多圓形的損傷細胞；模型+西格列汀組、模型+利格列汀組、模型+維格列汀組較模型組細胞形態得到改善，恢復到正常狀態下的細長、多角形態。見OSID碼圖1。

2.2 各組細胞增殖能力比較 對照組、模型組、模型+西格列汀組、模型+利格列汀組、模型+維格列汀組細胞存活率分別為100.00% ± 0.00%、81.85% ±0.64%、96.04% ± 2.43%、90.74% ± 1.32%、88.59% ± 0.76%；模型組細胞存活率低于對照組、模型+西格列汀組、模型+利格列汀組、模型+維格列汀組（P均＜0.05），對照組、模型+西格列汀組、模型+利格列汀組、模型+維格列汀組比較差異無統計學意義。

2.3 DPP-4 抑制劑作用于PD 的相關靶點收集結果 共收集西格列汀藥物靶點486 個、利格列汀藥物靶點665 個、維格列汀藥物靶點524 個、沙格列汀藥物靶點507個、阿格列汀藥物靶點408個，PD 疾病相關靶點1 121 個。將5 種DPP-4 抑制劑的靶點分別與PD 疾病相關靶點取交集分別得到80、76、88、77、62 個交集靶點，將交集靶點進行二次取交集，共得到DPP-4 抑制劑作用于PD 的36 個相關靶點。見OSID碼圖2。

2.4 DPP-4 抑制劑作用于PD 的關鍵靶點篩選結果 PPI 網絡顯示，DPP-4 抑制劑作用于PD 相關靶點中Degree 值＞平均值（12.7）的關鍵靶點共有16個，分別為ALB、IGF1、STAT3、CASP3、EGFR、ESR1、MAPK14、PPARG、MAPK1、HMOX1、NOS3、REN、MMP3、IL2、AR、IGF1R。見OSID碼圖3。

2.5 DPP-4 抑制劑作用于PD 的關鍵靶點GO 基因功能與KEGG 作用通路分析結果 GO 分析結果顯示，DPP-4 抑制劑作用于PD 的關鍵靶點共同涉及的生物過程主要包括信號轉導、細胞遷移的正向調控和細胞凋亡的負向調控等，細胞組分主要包括細胞質、細胞質膜、細胞核和大分子配合物等，分子功能主要包括酶結合、蛋白質結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等。KEGG 通路富集分析共得到20 條信號通路，與PD 較為相關的信號通路為PI3KAKT 信號通路、FoxO 信號通路、MAPK 信號通路等。見OSID碼圖4、5。

2.6 DPP-4 抑制劑作用于PD 的核心靶點篩選結果 藥物—疾病—靶點—通路網絡圖顯示，在PI3KAKT、FoxO 及MAPK 信號通路中均有富集的靶點為IGF1、EGFR、IGF1R及MAPK1。見OSID碼圖6。

2.7 核心靶點的分子對接驗證結果 分子對接結果顯示，5 種DPP-4 抑制劑均與PD 相關核心靶點蛋白有較好的結合，其結合能均小于-5.0 kcal/mol。見OSID碼圖7。

3 討論

PD 是常見的中樞神經系統退行性疾病，在中老年人中多發并呈現年輕化趨勢［8］。DPP-4 抑制劑是新型T2DM 治療藥物，而T2DM 與PD 之間存在一定聯系。有研究顯示，T2DM 不僅是PD 發病的危險因素，而且是PD 運動及非運動癥狀的改變因素［9］。并且，存在糖尿病并發癥的人群罹患PD的風險也會升高［10］。一項病例對照研究顯示，服用DPP-4 抑制劑的病例展現出較低的PD發病率［11］；一項回顧性研究也發現，服用DPP-4抑制劑的糖尿病PD 患者顯示出更高的多巴胺轉運體基線和更好的運動功能［12］。基于T2DM 與PD 之間的聯系，理論上降糖藥物或抗糖尿病的方法可能成為治療或者改善PD 或糖尿病合并PD 的新選擇。DPP-4 抑制劑是近幾年上市的新型口服降糖藥物，其通過增加腸促胰素水平間接刺激胰島β細胞分泌胰島素來發揮降糖作用。近期一項病例對照研究結果表明，接受DPP-4 抑制劑治療與T2DM 及T2DM 合并PD 患者的未來PD 發展風險呈負相關［13］。因此，評估現有的抗糖尿病藥物在神經退行性疾病中的作用，并且基于PD和糖尿病的相關性及共同病理機制，權衡抗糖尿病藥物修飾或改善PD 進展的可能性具有重要意義［12］。探討DPP-4抑制劑對PD的干預作用及其相關機制或可為PD的治療提供新的方向。

為了在細胞水平上初步驗證DPP-4 抑制劑對PD 的保護作用，我們選用大鼠PC-12 細胞作為本研究的實驗細胞。PC-12 細胞能表達酪氨酸羥化酶并合成多巴胺，是國內外神經退行性疾病研究中常用的體外實驗細胞，具有增長速度塊、傳代穩定、對細胞生長環境要求不高等優點，是神經系統疾病研究的較為成熟的模擬實驗對象［14］。PD 的體外建模方法有很多種，其中利用ROT 建立損傷模型是較為成熟的方法。ROT 導致PD 的毒性機制受多因素的影響，如α 突觸核蛋白異常聚集、線粒體功能異常、活性氧產生增加、抗氧化防御系統受損及細胞異常凋亡等［15］。本研究選擇ROT 作為PC-12 細胞PD 模型建立的造模藥物，結合前期預實驗結果和參考文獻報道，選擇0.2 μmol/L 的ROT 濃度作為PD 模型的造模濃度。通過細胞形態學觀察、CCK-8 法觀察西格列汀、維格列汀和利格列汀與ROT 共同干預后的PC-12 細胞增殖情況發現，與對照組比較，模型組細胞增殖受到抑制、細胞形態受損，提示0.2 μmol/L的ROT 建立PD 體外模型造模成功。在ROT 基礎上，同時加入西格列汀、利格列汀和維格列汀后，與模型組比較，細胞存活率升高，細胞形態更為完整。皺縮變形的細胞群體占比例更小，細胞形態接近對照組細胞，同時細胞存活率也得到了改善。這些結果進一步提示DPP-4 抑制劑組能夠提高細胞存活率，阻斷ROT對PC-12細胞的損傷，起到保護細胞形態完整和增殖能力的作用。

網絡藥理學以網絡靶標作為核心要點，在藥物發現、藥物解析及治療疾病方面發揮獨特優勢，可以作為單體藥物、中醫藥領域藥理作用靶點解釋方面很好的工具［16］。本研究利用網絡藥理學方法得到了5 種DPP-4 抑制劑作用于PD 的36 個相關靶點及16個關鍵靶點。GO富集結果表明，關鍵靶點可能主要通過酶結合、蛋白質結合等方式在細胞質、細胞質膜、細胞核等處發揮信號轉導、細胞遷移的正向調控和細胞凋亡的負向調控等生物行為。對關鍵作用靶點的KEGG 通路分析結果表明，DPP-4 抑制劑作用于PD 產生干預作用的主要機制很可能與PI3KAKT、FoxO、MAPK 等信號通路有關。建立藥物—疾病—靶點—通路網絡顯示，IGF1、EGFR、IGF1R 和MAPK1 這4 個靶點除了Degree 值較高外，均富集在PI3K-AKT、FoxO 和MAPK 信號通路，且分子對接結果也顯示，IGF1、EGFR、IGF1R 和MAPK1 與DPP-4抑制劑之間主要通過氫鍵相結合，其結合能均小于-5.0 kcal/mol，提示以上靶點可能是DPP-4 抑制劑在PD治療方面發揮重要作用的靶點。

研究表明，胰島素/IGF1 信號通路受損可能與PD 的病理生理過程有關。PD 患者中胰島素/IGF1信號發生改變，可表現為黑質致密部嚴重變性，胰島素受體底物1 表達增加［17-18］。在DPP-4 抑制劑治療PD 的靶點中，IGF1 和IGF1R 具有較高的Degree 值，在二次交集靶點的KEGG信號通路結果也顯示，5種DPP-4抑制劑通過這兩個通路發揮作用。因此DPP-4抑制劑改善PD 的作用可能是通過調節IGF1 來實現。此外，MAPK1 也參與多種細胞過程，如細胞周期、細胞凋亡、細胞存活等，在PD病程進展過程中發揮一定作用［19］。在PD 病理生理過程中，激活PI3K/AKT 信號通路能夠促進內皮細胞存活，限制神經元損傷，并阻斷炎癥神經元死亡。研究顯示，AKT 可通過抑制促凋亡細胞因子同時激活抗凋亡細胞因子來調節促凋亡和抗凋亡之間的平衡，從而影響神經元存活［20］。這提示DPP-4 抑制劑很可能通過介導PI3K/AKT 信號通路和凋亡通路來保護神經元。由上可見，DPP-4 抑制劑治療PD 的過程是一個多靶點，多通路共同作用的結果，其中PI3K-AKT 通路和胰島素抵抗通路可能發揮主要的作用。

綜上所述，前述網絡藥理學研究結果中，我們發現DPP-4 抑制劑對PD 體外模型具有積極地干預作用，其可能通過IGF1、EGFR、IGF1R 及MAPK1 等核心靶點作用于PI3K-AKT、FoxO、MAPK 等信號通路發揮作用。PD 的病理生理過程是復雜的，因此應被視為一種全身性疾病，而不僅僅是一種神經退行性疾病，包括DPP-4 抑制劑等用于治療T2DM 的手段有望在單純T2DM 中預防或者降低PD 的發生概率，且在T2DM合并PD中治療或改善PD癥狀。