宮頸癌輻射敏感性差異基因的篩選及免疫相關(guān)性分析

胡煜，王含夢(mèng)，陳然眾，彭昌民，李樂(lè)，唐雙陽(yáng)

1 南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南衡陽(yáng) 421001；

2 南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所

宮頸癌是發(fā)生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。放射治療是指利用由輻射產(chǎn)生的粒子束治療惡性腫瘤的方法，是治療包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤的常用手段，但放療對(duì)晚期宮頸癌的治療效果較差［1］。免疫治療指利用宿主免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細(xì)胞從而治療癌癥［2］，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化治療失敗的宮頸癌患者，免疫治療是可改善其預(yù)后的一種治療手段［3］。放射治療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)可以產(chǎn)生深遠(yuǎn)的免疫刺激作用，有助于使免疫治療不敏感腫瘤變得敏感，因此放射治療及免疫治療聯(lián)合應(yīng)用對(duì)惡性腫瘤具有良好的治療前景。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展、輻射敏感性、免疫刺激反應(yīng)都受細(xì)胞內(nèi)某些基因的調(diào)控，尋找在這三者中均發(fā)揮作用的基因可能有助于更好的了解宮頸癌的免疫放射聯(lián)合治療機(jī)制。2022 年10 月—2023 年6月，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選影響宮頸癌輻射敏感性的相關(guān)差異基因并進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證以及免疫相關(guān)性分析，以期為宮頸癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 宮頸癌輻射敏感性差異基因的篩選

1.1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源及處理 從Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www. ncbi. nlm. nih.gov/geo/）中下載基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE6213、GSE166466、GSE6791、GSE64217，分別基于平臺(tái)GPL2895，GPL23126，GPL570 及GPL10588，其中GSE6213 數(shù)據(jù)集包含放療前后宮頸癌組織共28個(gè)樣本，GSE166466、GSE6791、GSE64217 數(shù)據(jù)集分別包含14、16、4 個(gè)正常宮頸組織及宮頸癌組織樣本。對(duì)4 個(gè)數(shù)據(jù)集中的樣本數(shù)據(jù)均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.1.2 差異基因篩選 基于R 3.40.2軟件的limma包對(duì)GEO得到4個(gè)數(shù)據(jù)集的mRNA表達(dá)譜進(jìn)行校正和歸一，分析調(diào)整后的P值以糾正假陽(yáng)性結(jié)果。以調(diào)整后P＜0.05 且|log2FC|＞1 作為宮頸癌輻射敏感性差異基因篩選的閾值。使用韋恩圖將得到的差異基因取交集。

1.2 宮頸癌輻射敏感性差異基因的表達(dá)驗(yàn)證

1.2.1 差異基因的表達(dá)分析 從The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)及Genotype-Tissue Expression（GTEx）數(shù)據(jù)庫(kù)收集306 例宮頸癌組織樣本、22例正常宮頸組織樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)及患者臨床資料、隨訪數(shù)據(jù)，通過(guò)Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA2）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的宮頸癌輻射敏感性差異基因進(jìn)行表達(dá)分析，驗(yàn)證所選差異基因是否可靠。以P＜0.01 且|log2FC|＞1 作為基因差異表達(dá)的閾值，其中P＜0.01 且|log2FC|＞1 為基因在宮頸癌組織中高表達(dá)，P＜0.01且|log2FC|＜1為基因在宮頸癌組織中低表達(dá)。

1.2.2 差異基因的生存分析及關(guān)鍵差異基因篩選通過(guò)GEPIA2 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生存分析，將差異基因在腫瘤中的中位數(shù)作為高、低表達(dá)的分界線，以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選不同基因表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后有影響的差異基因?yàn)閷m頸癌輻射敏感性關(guān)鍵差異基因。

1.2.3 關(guān)鍵差異基因的預(yù)后分析 通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)及GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)收集宮頸癌患者臨床資料及隨訪數(shù)據(jù)，通過(guò)R 軟件“forestplot”包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素、多因素COX 回歸分析，驗(yàn)證篩選出的關(guān)鍵差異基因是否為宮頸癌患者預(yù)后的影響因素。

1.2.4 關(guān)鍵差異基因的蛋白表達(dá)驗(yàn)證 通過(guò)The Human Protein Atlas（HPA）數(shù)據(jù)庫(kù)比較篩選出的關(guān)鍵差異基因在宮頸癌以及正常宮頸組織中的蛋白表達(dá)。

1.3 宮頸癌輻射敏感性差異基因的免疫相關(guān)性分析

1.3.1 關(guān)鍵差異基因GO功能及KEGG信號(hào)通路富集分析 基于LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)基因集富集分析得到關(guān)鍵差異基因的GO 功能及KEGG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果，其中GO 分析包括生物過(guò)程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞成分（CC）。

1.3.2 關(guān)鍵差異基因免疫相關(guān)性分析 通過(guò)Tumor Immune Estimation Resource（TIMER）數(shù)據(jù)庫(kù)分析關(guān)鍵差異基因在宮頸癌中的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的關(guān)系。通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)使用CIBERSORT 進(jìn)行免疫評(píng)分并觀察免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因的表達(dá)情況，通過(guò)R 軟件包“ggplot2”及“pheatmap”對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化，將關(guān)鍵差異基因與宮頸癌高度相關(guān)的免疫檢查點(diǎn)基因使用Spearman 進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌輻射敏感性差異基因篩選結(jié)果GSE6213、GSE166466、GSE6791、GSE64217GSE6213數(shù)據(jù)集中分別篩選出差異基因417、2 799、2 347、4 092 個(gè)，通過(guò)韋恩圖將差異基因取交集，篩選出共同差異基因10 個(gè)，分別為HELLS、TOP2A、KIF23、TAP1、WDR76、LMNB1、RFC4、TFRC、IFI44L、IFIT3。見OSID碼圖1

2.2 宮頸癌輻射敏感性差異基因表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果表達(dá)分析結(jié)果顯示，10 個(gè)差異基因均在宮頸癌組織中高表達(dá)（OSID 碼圖2）；生存分析結(jié)果顯示，TFRC 高表達(dá)的宮頸癌患者總生存率及無(wú)病生存率低于TFRC 低表達(dá)的患者，其他差異基因高、低表達(dá)患者總生存率及無(wú)病生存率比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OSID 碼圖3）。故選擇TFRC 為宮頸癌輻射敏感性關(guān)鍵差異基因進(jìn)行后續(xù)研究。單因素COX 回歸分析結(jié)果顯示，TFRC 及宮頸癌TNM 分期是宮頸癌患者預(yù)后的影響因素（OSID 碼圖4）；多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，TFRC 及宮頸癌TNM 分期是宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（OSID 碼圖5）。通過(guò)HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證TFRC 在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示TFRC 在正常宮頸組織中未檢測(cè)到，在宮頸癌組織中呈高表達(dá)（OSID碼圖6）。

2.3 宮頸癌輻射敏感性差異基因的免疫相關(guān)性分析結(jié)果 GO 功能分析顯示，TFRC 主要涉及染色體分離、RNA 定位、適應(yīng)性免疫反應(yīng)等BP（OSID 碼圖7），染色體區(qū)、核糖前體、免疫突觸等CC（OSID 碼圖8），解旋酶活性、組蛋白結(jié)合、抗原結(jié)合等MF（OSID 碼圖9）。KEGG 信號(hào)通路富集分析顯示，TFRC 主要與RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞周期、同種異體移植物排斥反應(yīng)等信號(hào)通路有關(guān)（OSID 碼圖10）。TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，宮頸癌中TFRC 表達(dá)與細(xì)胞純度呈正相關(guān)，與CD8+T 淋巴細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，TFRC 表達(dá)影響記憶B 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M0、靜息肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)程度（OSID 碼圖11）。Spearman 相關(guān)性分析顯示，TFRC 表達(dá)與大部分宮頸癌免疫檢測(cè)點(diǎn)相關(guān)基因呈負(fù)相關(guān)（OSID碼圖12）。

3 討論

目前，放射與免疫聯(lián)合治療是一種較有潛力的，可改善宮頸癌患者預(yù)后的治療方法，因此尋找宮頸癌輻射敏感性差異基因并探討其免疫功能及致病機(jī)制對(duì)宮頸癌的治療有重要意義。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選出了同時(shí)影響宮頸癌發(fā)生進(jìn)展及輻射敏感性的關(guān)鍵差異基因TFRC。

TFRC 是一種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，其主要功能是與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合從而影響細(xì)胞對(duì)鐵的吸收。而細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的鐵會(huì)誘導(dǎo)芬頓反應(yīng)，造成DNA 損傷或細(xì)胞死亡［4］。鐵死亡是一種新型的程序性細(xì)胞死亡，其特征是線粒體的改變、過(guò)量鐵的異常積累以及脂質(zhì)堆積，積累的脂質(zhì)過(guò)氧化物會(huì)損傷細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，TFRC 在宮頸癌中高表達(dá)。同時(shí)，多項(xiàng)研究表明，TFRC 在其他腫瘤中也存在高表達(dá)，如在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，TFRC 過(guò)表達(dá)并誘導(dǎo)了神經(jīng)母細(xì)胞瘤對(duì)鐵死亡的選擇性敏感［5］；在膠質(zhì)瘤中，TFR2 高表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)，且TFR2 過(guò)表達(dá)能通過(guò)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化促進(jìn)鐵死亡［6］；在胰腺癌中，TFRC 表達(dá)水平增加且與不良預(yù)后相關(guān)［7］；在卵巢癌中，TFRC 通過(guò)上調(diào)AXIN2 表達(dá)促進(jìn)卵巢癌上皮細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［8］；在結(jié)腸癌中，TFRC 高表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞存活，抑制TFRC表達(dá)能增強(qiáng)DNA 損傷反應(yīng)，降低結(jié)腸腫瘤生長(zhǎng)速度［9］。在宮頸癌中，TFRC 能通過(guò)影響HeLa 細(xì)胞的基因表達(dá)和選擇性剪接參與宮頸癌的進(jìn)展［10］，且TFRC高表達(dá)可上調(diào)EIF4A3從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，TFRC 表達(dá)上調(diào)對(duì)宮頸癌預(yù)后不利。但也有研究發(fā)現(xiàn)，TFRC 作為鐵代謝重要蛋白，其表達(dá)升高可以增加氧氣的運(yùn)輸，改善缺氧，使HIF-α 蛋白更容易羥基化，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［12］。因此，TFRC 可能通過(guò)多種機(jī)制影響宮頸癌的進(jìn)展。

在TFRC 影響腫瘤細(xì)胞輻射敏感性方面，有研究表明，在人外周血B 淋巴細(xì)胞AHH-1 中，TFRC 的表達(dá)對(duì)低劑量輻射敏感［13］。而由于TFRC 可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)鐵蛋白來(lái)參與細(xì)胞內(nèi)鐵的調(diào)節(jié)，有研究表明在三陰性乳腺癌中，沉默轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá)可以減少輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡［14］；在鼻咽癌中，放療前的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白水平會(huì)影響鼻咽癌患者放射敏感性［15］。關(guān)于TFRC 在宮頸癌中如何影響輻射敏感性目前還缺乏研究，但推測(cè)其可能通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白影響宮頸癌的輻射敏感性，后續(xù)可以進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證。同時(shí)，本研究對(duì)TFRC 進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路富集分析顯示，TFRC 可通過(guò)影響細(xì)胞周期發(fā)揮作用，而細(xì)胞周期可能是影響輻射敏感性的重要因素之一，這也提示TFRC 能夠影響宮頸癌的輻射敏感性［16］。

在TFRC 影響免疫學(xué)效應(yīng)方面，有研究發(fā)現(xiàn)TFRC 突變會(huì)導(dǎo)致小鼠聯(lián)合免疫缺陷，提示TFRC 在適應(yīng)性免疫中具有重要作用［17］；在胰腺癌和肝細(xì)胞癌中，TFRC 與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)［7，18］；在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，患者疾病嚴(yán)重程度與TFRC 表達(dá)相關(guān)，且體外阻斷TFRC 能降低T 淋巴細(xì)胞內(nèi)鐵攝取水平并抑制mTORC1 信號(hào)，從而導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞功能障礙［19］。本研究結(jié)果顯示，在宮頸癌中TFRC 與CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)。通過(guò)對(duì)TFRC進(jìn)行GO功能分析發(fā)現(xiàn)，TFRC 可能與適應(yīng)性免疫反應(yīng)相關(guān)。對(duì)TFRC 進(jìn)行免疫相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，TFRC 與大部分宮頸癌相關(guān)的免疫檢測(cè)點(diǎn)基因呈負(fù)相關(guān)，這些都提示其可在宮頸癌的免疫治療中發(fā)揮作用，但具體機(jī)制仍不明確。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TFRC 為宮頸癌輻射敏感性差異基因，其可能與適應(yīng)性免疫反應(yīng)、宮頸癌相關(guān)的免疫檢測(cè)點(diǎn)相關(guān)；這提示TFRC 可在宮頸癌的放射免疫治療中發(fā)揮作用，從而影響宮頸癌的進(jìn)展和預(yù)后。TFRC 可以作為預(yù)測(cè)宮頸癌患者免疫放射治療效果及其預(yù)后的潛在靶點(diǎn)，但其具體作用機(jī)制仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)論證。