白色念珠菌致病機制研究進展

駱陽，徐興偉，嵇武

1 南京醫科大學金陵臨床醫學院 東部戰區總醫院普外科，南京 210002；

2 浙江大學醫學院附屬第一醫院結直腸外科

隨著二代測序技術的不斷發展，人們在腸道微生物組中發現了除細菌以外的另一重要組群的存在，即共生真菌組。共生真菌多樣性及豐度的改變已被證明與多種疾病相關，例如炎癥性腸病、結直腸癌、抗生素相關性腹瀉、腸易激綜合征以及過敏性鼻炎等［1-5］。作為一種機會性致病菌，共生真菌在機體免疫功能低下、藥物干預等多種情況下可引發疾病。對于腸道而言，定植在腸道的共生真菌會損害并突破腸黏膜屏障發生菌群易位，引發腸道炎癥反應，甚至侵入循環系統，造成播散性真菌病。白色念珠菌作為腸道共生真菌的優勢菌群，其群落形態、豐度的改變可隨機體免疫狀態而發生變化，可通過形成菌絲體、分泌念珠菌溶素及分泌細胞外囊泡（EVs）等多種機制損傷機體上皮細胞、內皮細胞以及各種免疫細胞，從而導致疾病發生。然而，目前對白色念珠菌通過何種方式引發疾病以及疾病的進展又如何影響真菌多樣性和豐度變化的認識依舊不夠全面，導致臨床治療手段也較為局限。因此，深入探究白色念珠菌的致病機制對于進一步認識真菌，探尋新的治療方法具有重要意義。現就白色念珠菌致病機制研究進展綜述如下。

1 白色念珠菌通過形成菌絲體導致疾病發生

白色念珠菌具有分化成多種形態的能力，其分化形態包括但不限于單細胞酵母、假菌絲、菌絲、生物膜狀態以及獨特的孢子形態，不同狀態的白色念珠菌具有獨特的生物學作用。白色念珠菌發生形態轉變的基礎是其獨特的細胞壁組成。白色念珠菌的細胞壁具有兩層結構，內層由幾丁質、β-1，3-葡聚糖及β-1，6-葡聚糖組成，外層是富含N-或O-連接的甘露聚糖修飾的蛋白質，稱為甘露糖蛋白［6］。在機體免疫功能正常時，大部分白色念珠菌以酵母形態黏附在腸黏膜上，此時低表達毒力因子，主要對機體的免疫系統起到塑造作用，代表著與機體共生適應［7］。而當受到各種刺激或生存環境改變時，白色念珠菌會從酵母狀態轉變為菌絲狀態，可造成組織入侵及免疫逃避［8］。因此，普遍認為絲狀化是白色念珠菌的主要毒力特性之一。與白色念珠菌菌絲形成相關的基因包括ADH1、ALS3、BMH1、RBT1、UBP8、UME6 及UTR2 等［8-10］。cAMP-PKA 通路被認為是白色念珠菌絲狀化的主要信號通路，并多次在體外試驗中被證實。但PARRINO 等［11］通過體外構建了缺乏腺苷酸環化酶（AC）的假回復白色念珠菌株，發現缺乏AC 的部分白色念珠菌能夠以不依賴cAMP 的方式完成絲狀化。同樣的，WAKADE 等［12］在體內實驗中也證實AC 缺失的白色念珠菌依舊能夠順利完成絲狀化。這提示白色念珠菌絲狀化是極其復雜的過程，有多條信號傳導通路。一般認為，完成絲狀化的白色念珠菌通過菌絲以物理方式刺破吞噬體的細胞膜，但也有學者提出，菌絲形成只是白色念珠菌殺死吞噬細胞的形態基礎，暴露的菌體細胞壁糖基化蛋白誘導吞噬體程序性死亡啟動，是觸發宿主細胞死亡的更深層機制，并最終完成免疫逃逸造成播散［13］。

2 白色念珠菌通過分泌念珠菌溶素導致疾病發生

念珠菌溶素是由MOYES 等［14］于2016 年在白色念珠菌中發現的第一種真菌溶細胞肽毒素，其是白色念珠菌的致病因子之一。念珠菌溶素是由基因ECE1編碼翻譯后的產物，ECE1呈α-螺旋并包含7個KR（賴氨酸—精氨酸）位點，首先經過蛋白內切酶Kex2p 切割加工產生未成熟的念珠菌溶素，然后由羧肽酶Kex1p 進一步去除C 末端的精氨酸，形成有活性的成熟念珠菌溶素［14］。

念珠菌溶素可通過多種方式導致細胞壞死。BLAGOJEVIC 等［15］研究發現，白色念珠菌菌絲可與上皮細胞頂端膜接觸形成凹陷的“侵入袋”，有利于念珠菌溶素的聚集，其C末端帶正電荷的KR殘基能夠與質膜上帶負電荷的成分相互作用并成孔，以Ca+內流的方式造成胞內線粒體膜去極化并失活破裂，釋放大量活性氧，導致上皮細胞壞死并引發炎癥反應。HO 等［16］發現，在Ca+內流和基質蛋白酶MMP 的協助下，念珠菌溶素可能通過EREG、EPG 和AREG等配體激活表皮生長因子受體，接著激活下游MAPK 信號傳導，釋放大量粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子，募集中性粒細胞、巨噬細胞等免疫細胞聚集，從而引發局部炎癥反應。SWIDERGALL 等［17］研究表明，念珠菌溶素能夠通過MEK1/2 及ERK1/2誘導MAPK 信號傳導，導致AP-1 轉錄因子 c-Jun/c-Fos 激活并上調中性粒細胞募集趨化因子CXCL8的分泌，導致大量中性粒細胞募集至感染部位，引發過度的炎癥反應，造成血管內皮細胞損傷。而被巨噬細胞吞噬的白色念珠菌也可通過念珠菌溶素促使巨噬細胞K+外流，激活NLRP3 炎癥小體，介導白細胞介素1β（IL-1β）大量分泌，進而引發巨噬細胞腫脹破裂，作為白色念珠菌逃避吞噬的機制之一［18］。

當白色念珠菌隨血流播散至腸外時，可能引發更為嚴重的疾病。近年來發現，白色念珠菌與過敏性哮喘之間存在極為密切的關聯。WU 等［5］研究發現，念珠菌溶素能夠通過VWF受體GP1bα激活血小板以釋放Wnt 拮抗劑Dkk-1，啟動依賴Th2 和Th17細胞的抗真菌反應，但當這種真菌感染不能及時控制時，就會引發哮喘等嚴重過敏反應。念珠菌屬的大部分菌種都能夠分泌念珠菌溶素，但不同菌種分泌的念珠菌溶素也存在差異。RICHARDSON 等［19］發現，都柏林念珠菌和熱帶念珠菌分泌的念珠菌溶素也是一種由ECE1 編碼的α-螺旋肽毒素，但引起Ca+內流造成上皮損傷的能力比白色念珠菌更強。同時，該研究團隊認為可以把念珠菌溶素看作一個新的功能活性肽毒素家族，作為人類致病真菌中第一個溶細胞肽毒素家族。

3 白色念珠菌通過分泌EVs導致疾病發生

EVs是由各種組織和細胞分泌的被脂質雙層膜所包裹的膜囊泡總稱，其中包含各種蛋白質、脂質、聚糖、核酸以及mRNA 等生物活性物質［20］。美國科學家ANDERSON 在1990 年首次通過電鏡技術觀察到白色念珠菌分泌的一種不透明丘疹樣囊泡，并發現囊泡中的酸性蛋白酶是白細胞的10 倍以上。但限于當時的技術，無法對囊泡結構、功能和分泌機制展開深入研究。直到2008 年人們發現白色念珠菌分泌的囊泡與其他子囊菌一樣，都屬于EVs。隨著研究的深入，學者們逐漸揭示了白色念珠菌EVs 的組成和功能，并且發現EVs 是白色念珠菌的致病因素之一。

VARGAS 等［21］在兩種白色念珠菌菌株ATCC 90028、ATCC 11 分泌的EVs 中共鑒定出57 種蛋白，分布上，64%的蛋白定位于細胞壁和細胞質；功能上，24%的蛋白與致病相關，23%的蛋白與脂質、糖和蛋白質等代謝相關，22%的蛋白與細胞組織和生物發生相關。該研究還通過高效薄層色譜法對EVs的脂質成分進行鑒定，發現麥角甾醇、中性鞘糖脂和葡糖神經酰胺（G1cCer）為主要成分，而G1cCer 最近被發現為白色念珠菌的關鍵毒力因子。GIL-BONA等［22］在白色念珠菌分泌的EVs 中共鑒定出75 種蛋白，其中53%與細胞壁和跨膜蛋白相關，如甘露糖蛋白Mp65、黏附樣蛋白Sim1、細胞壁糖苷酶Sun41、Tos1、Scw11、Xog1 及幾丁質酶Cht3，提示EVs 的分泌與菌體細胞壁的關系十分密切。內吞體運輸必需分選復合物（ESCRT）是一類與細胞中膜結構重構有關的重要蛋白復合物，在膜蛋白降解、信號傳導、病毒出芽、細胞分裂、膜損傷修復等諸多重要過程中發揮作用。而ZARNOWSKI 等［23］研究發現，ESCRT 對于真菌EVs從胞內到胞外的轉運有重要作用。

為了更好地模擬疾病狀態下宿主—病原體相互作用，KONE?Ná 等［24］在營養有限（缺乏氨基酸）的培養基上種植白色念珠菌（ATCC 90028和一例臨床患者分離出的菌株），檢測到3 種只存在于ATCC 90028 菌株中的毒力相關蛋白：凝集素樣蛋白3（Als3）、分泌型天冬氨酸蛋白酶8（SAP8）和細胞表面超氧化物歧化酶銅—鋅6（SOD6），而相較于在營養豐富情況下培養的菌株ATCC 90028，SAP 家族蛋白只在營養物質匱乏的環境中發現，這提示營養條件改變會影響真菌EVs 的組成。MARTíNEZLóPEZ 等［25］對比分析了白色念珠菌（ATCC SC5314）菌絲態與酵母態EVs 的差異，雖然酵母態EVs（YEVs）體積普遍大于菌絲態EVs（HEVs），但HEVs中包含的蛋白遠多于YEVs，在HEVs 中鑒定出的1 598 種蛋白，其中大部分與細胞壁組成、蛋白轉運和代謝蛋白相關，這可能是為了更好地黏附免疫細胞進而與之相互作用。并且，研究者還在HEVs 中發現了一種獨特的20 S 蛋白酶體復合物，這種復合物具有高度水解酶的活性，同樣也提示菌絲態的菌株具有高度侵襲性和致病性。以上研究表明，白色念珠菌在不同環境中、不同形態下分泌的EVs，其組成和功能具有高度差異性。

白色念珠菌分泌的EVs 具有免疫原性，能夠引起機體免疫細胞分泌多種細胞因子。巨噬細胞在吞噬EVs后，產生大量一氧化氮、IL-1、轉化生長因子β（TGF-β）及IL-10 等炎癥因子。同樣，經EVs 處理后的樹突樣細胞（DC），IL-12、IL-10、TGF-β 及腫瘤壞死因子α 的合成顯著增加，EVs 還可誘導DC 表面CD86 和主要組織相容性復合物Ⅱ的上調［20］。一項研究使用蛋白酶K、核酸酶及核糖核酸酶A 水解馬爾尼菲籃狀菌分泌的EVs，發現只有蛋白酶K 水解后的EVs與免疫細胞作用后未能引起上述炎癥因子的釋放［26］。雖然沒有關于白色念珠菌此方面的研究，但我們可以推測EVs 中包含的大量蛋白質是與宿主免疫細胞作用的主要成分。

此外，HALDER 等［27］發現，白色念珠菌亦可利用單核細胞分泌的EVs 來減輕機體免疫反應，從而逃避吞噬。白色念珠菌細胞壁中β-葡聚糖通過與單核細胞膜上的補體受體b3（CR3）結合，誘導單核細胞TGF-β1轉運EVs 的產生，包含TGF-β1的EVs 可結合其他單核細胞上的TGF-βRⅡ，增加SMAD2/3磷酸化，上調SMAD7 及下游NF-κB 抑制劑的表達，導致促炎因子IL-1β 表達減少。同時，包含TGF-β1的EVs還可與內皮細胞上的TGF-βRⅡ結合，上調包括TGF-β1在內的多種抗炎因子，從而進一步放大信號，發揮抗炎作用，減輕免疫反應，有利于白色念珠菌的存活及逃逸。該研究團隊在后期實驗中再次發現白色念珠菌細胞壁上β-葡聚糖與甘露聚糖可分別結合單核細胞上的CR3 及TLR4 受體，進而導致單核細胞分泌包含has-miR-24-3p 的EVs，同時白色念珠菌通過C3b/iC3b與EVs 表面的CR1 結合，利用EVs 中的has-miR-24-3p 抑制自身細胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白SOL1 mRNA翻譯，從而導致白色念珠菌大量生長并絲狀化［28］。由上可見，白色念珠菌不僅可以通過自身分泌包含大量致病蛋白的EVs導致機體嚴重炎癥反應，還可以誘導一些免疫細胞分泌有利于自身生長的EVs 從而躲避免疫，增加感染風險。

綜上所述，白色念珠菌可通過形成菌絲體、分泌念珠菌溶素及分泌EVs 等多種機制導致疾病發生。多種信號傳導通路導致菌絲狀態的白色念珠菌是其與機體內細胞相互作用并分泌念珠菌溶素、細胞外囊泡等毒力因子的基礎。由此引發了我們的思考：是否可以通過藥物靶向抑制白色念珠菌菌絲形成轉導信號通路，在致病源頭對其進行控制；念珠菌溶素作為一種毒素，是否可以研制中和毒素的血清，減輕炎癥反應；EVs中包含大量菌體相關蛋白，是否可以分離出囊泡中的致病蛋白抗原，制備免疫制劑預防真菌感染。SINGH 等［29］研究發現，在大鼠體內接種白色念珠菌細胞壁蛋白ALS3、HYR1 抗原制劑后再次感染白色念珠菌的病死率顯著降低，雖然此方法應用于臨床患者依然還需克服諸多困難，但動物實驗取得的初步成功至少證明了理論的可行性。