腦膠質瘤患者血清miR-27b-3p水平與術后復發的相關性分析

馬強 楊震 程浩 鄭璐

安徽醫科大學第二附屬醫院，安徽 合肥 230000

腦膠質瘤是一種惡性程度高且預后差的中樞神經系統原發性腫瘤［1］。腦膠質瘤的標準治療方法是手術切除聯合放化療［2］。但由于膠質瘤浸潤性生長的特點，腫瘤組織大多不能通過手術完全切除，術后復發率和病死率很高，患者的中位生存期較短［3］。因此，尋找預測腦膠質瘤患者術后復發的生物標志物具有重要意義。微小RNAs（miRNAs）能夠與相應信使RNAs（mRNAs）的3’非翻譯區（3’UTR）結合，最終導致轉錄后抑制或靶基因的降解或沉默［4］。研究發現，約30%的人類基因可以被miRNAs 調控［5］。此外單個miRNA可以與十幾種mRNAs相互作用，最終同時影響許多基因的表達［6］。miRNAs的復雜調控功能通過影響細胞增殖、分化、侵襲、遷移和凋亡等多種生物學過程進而參與了一系列疾病的發生發展［7-8］。2002年首次發現與miRNAs相關的癌癥［9］。此后，越來越多的研究表明miRNAs 在多種惡性腫瘤中異常表達并參與了腫瘤發生發展的調控［10-14］。BAO等［15］報道miR-27b-3p通過靶向RUNX1及Hippo信號通路抑制了胃癌細胞的遷移、侵襲及上皮間質轉換。CHEN 等［16］報道miR-27b-3p 通過靶向LIMK1 抑制了結直腸癌細胞的增殖、遷移及侵襲。在膠質瘤中，miR-27b-3p也被報道發揮著抑癌作用［17］。然而，目前尚無研究報道腦膠質瘤患者血清miR-27b-3p水平與術后復發的相關性，本研究分析了腦膠質瘤患者血清miR-27b-3p在術后復發中的預測價值，旨在為腦膠質瘤患者術后復發的風險評估提供新的生物標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取安徽醫科大學第二附屬醫院及安徽省立醫院于2020-01—2022-12 接受手術治療的腦膠質瘤患者共65 例為研究對象，同期顱腦損傷患者25例納入對照組。腦膠質瘤組中男39例，女26例；年齡44～67（55.57±7.86）歲；腫瘤部位額葉32例，顳葉16 例，其他17 例；腫瘤直徑≥4.5 cm 共27例，腫瘤直徑＜4.5 cm 共38 例；WHO 分級Ⅰ～Ⅱ級26 例，WHO 分級Ⅲ～Ⅳ級39 例；手術完全切除22例，手術部分切除43 例。顱腦損傷患者男15 例，女10例；年齡45～69（56.08±8.09）歲。2組基本資料無顯著差異（P＞0.05）。本研究內容經醫院倫理委員會批準通過，患者或家屬均簽署知情同意。

1.2 腦膠質瘤組病例選擇標準納入標準：（1）患者符合腦膠質瘤的診斷標準［18］，且經病理及CT檢查確診；（2）首次確診，且術前未接受任何其他治療；（3）患者接受手術治療。排除標準：（1）合并其他腦部疾病者；（2）合并重要器官功能障礙者；（3）合并精神類疾病者；（4）合并其他類型惡性腫瘤；（5）患者依從性差；（6）妊娠期或哺乳期女性。

1.3 檢測方法手術完成2周后收集腦膠質瘤患者空腹靜脈血5 mL，離心后取上層血清備用。采用血清RNA提取試劑盒提取血清總RNA，逆轉錄獲得cDNA，采用實時定量逆轉錄聚合酶聯式反應進行擴增，測定血清miR-27b-3p 水平。反應條件為96 ℃3 min；95 ℃30 s；59 ℃30 s；72 ℃40 s；71 ℃5 min，共進行39個循環。分析Ct值，采用2-ΔΔCT法計算miR-27b-3p水平。miR-27b-3p 及內參基因U6 的引物序列如下：miR-27b-3p正向引物：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCA GTTGAGGCAGAACT-3’，miR-27b-3p 反向引物：5’-ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAG-3’。U6正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6 反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 復發隨訪術后隨訪6 個月，患者復查MRI 顯示腫瘤生長范圍較術前擴大或腫瘤出現在不同部位時為復發。

1.5 統計學分析采用Graphpad Prism 8.0 進行數據分析，正態分布的計量數據以平均值±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；分類數據以例表示，組間比較采用卡方檢驗；采用Cox回歸分析探討腦膠質瘤患者術后復發的危險因素；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線評估血清miR-27b-3p 水平對患者術后復發的預測價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組患者血清miR-27b-3p表達水平比較腦膠質瘤組患者血清miR-27b-3p表達水平（4.57±1.38）顯著低于顱腦損傷組（9.46±1.97），差異有統計學意義（t=11.370，P＜0.001）。

2.2 腦膠質瘤患者術后復發影響因素的單因素分析根據患者術后6個月的隨訪結果，將患者分為復發組（n=17）及未復發組（n=48），比較2 組患者年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、WHO 分級、手術切除程度及血清miR-27b-3p 水平。經分析發現2 組患者年齡、性別及腫瘤位置無統計學差異（P＞0.05）；2 組患者在腫瘤直徑、WHO 分級、手術切除程度及血清miR-27b-3p 水平方面存在統計學差異（P＜0.05）；腫瘤直徑≥4.5 cm、WHO 分級Ⅲ～Ⅳ級、手術未完全切除及低水平的miR-27b-3p 患者較腫瘤直徑＜4.5 cm、WHO 分級Ⅰ～Ⅱ級、手術完全切除及高水平的miR-27b-3p患者更易復發。見表1。

表1 腦膠質瘤患者術后復發影響因素的單因素分析Table 1 Univariate analysis of factors influencing postoperative recurrence in glioma patients

2.3 腦膠質瘤患者術后復發影響因素的多因素Cox回歸分析以患者術后6個月的復發情況（未復發賦值為0，復發賦值為1）為因變量，以腫瘤直徑（＜4.5 cm賦值為0，≥4.5 cm賦值為1）、WHO分級（Ⅰ～Ⅱ級賦值為0，Ⅲ～Ⅳ級賦值為1）、手術是否完全切除（是賦值為0，否賦值為1）及miR-27b-3p 水平（高表達賦值為0，低表達賦值為1）為自變量進行多因素Cox回歸分析。經分析發現腫瘤直徑≥4.5 cm、WHO分級Ⅲ～Ⅳ級、手術未完全切除及miR-27b-3p低表達是腦膠質瘤患者術后復發的獨立危險因素（P＜0.05）。見表2。

表2 腦膠質瘤患者術后復發影響因素的多因素Cox回歸分析Table 2 Multivariate Cox regression analysis of factors influencing postoperative recurrence in glioma patients

2.4 腦膠質瘤患者血清miR-27b-3p 水平與臨床病理特征的關系探討本研究進一步分析了腦膠質瘤患者血清miR-27b-3p水平與腫瘤直徑、WHO分級及手術是否完全切除的關系，結果顯示腫瘤直徑≥4.5 cm及WHO 分級Ⅲ～Ⅳ級患者血清miR-27b-3p 水平顯著低于腫瘤直徑＜4.5 cm及WHO分級Ⅰ～Ⅱ級的患者（P＜0.05）。見表3。

表3 腦膠質瘤患者血清miR-27b-3p水平與臨床病理特征的關系Table 3 Relationship between serum miR-27b-3p level and clinicopathological features in glioma patients

2.5 血清miR-27b-3p 表達預測腦膠質瘤患者術后復發的價值分析采用ROC 曲線分析了血清miR-27b-3p水平對腦膠質瘤患者術后復發的預測價值，結果顯示血清miR-27b-3p 預測腦膠質瘤患者最佳截斷值為4.738，靈敏度66.67%，特異性94.12%，術后復發的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.826（95%CI=0.7263～0.9257，P＜0.001）。當血清miR-27b-3p水平低于4.738時，腦膠質瘤患者術后復發的風險增加。見圖1。

圖1 血清miR-27b-3p表達預測腦膠質瘤患者術后復發的價值分析Figure 1 Value analysis of serum miR-27b-3p expression in predicting postoperative recurrence in patients with glioma

3 討論

膠質瘤是常見的原發性腦腫瘤，由于其浸潤生長的特點及腫瘤生長位置的限制，手術完全切除極為困難，因此患者術后復發及轉移率較高［19-20］。患者的預后通常是基于侵入性手術活檢得到的組織病理學和分子信息。然而，臨床上腦膠質瘤的多次重復活檢是不可行的。此外由于腫瘤的異質性，活檢也會出現抽樣誤差［21］。循環生物標志物具有微創性、易獲取及高重復性等優勢，已被廣泛用于各種疾病的診斷及預后評估［22-24］。miRNAs是一類長度為18～25個核苷酸的小非編碼RNAs，其可在轉錄后水平調控基因表達［25-26］。miRNAs已被證明在多種惡性腫瘤中發揮重要作用，參與調節腫瘤生長、血管生成及免疫入侵等多種生物學過程。此外，miRNAs能夠穿過血腦屏障并穩定存在于外周血，這一特點使其成為腦癌的理想生物標志物［27-28］。

目前，已有許多miRNAs被報道與腦膠質瘤的發生發展密切相關。GU 等［29］報道miR-218-5p 通過靶向TCF12 抑制了膠質瘤的惡性進展。CHEN 等［30］報道miR-376a-3p 通過負調控KLF15 抑制了膠質瘤的進展。miR-27b-3p也被報道作為抑癌因子參與了膠質瘤的發生發展過程。MIAO 等［17］報道miR-27b-3p通過靶向YAP1抑制了膠質瘤進展。ZHANG等［31］報道長鏈非編碼RNA LINC 01128通過靶向miR-27b-3p促進了膠質瘤細胞的增殖、遷移及侵襲，表明了miR-27b-3p 在膠質瘤中的抑癌角色。然而，目前尚無研究報道血清miR-27b-3p水平與腦膠質瘤患者術后復發的關系。

本研究顯示腦膠質瘤組患者血清miR-27b-3p表達水平顯著低于顱腦損傷組，這一結果提示血清miR-27b-3p 在膠質瘤患者中失調，且其可能參與了膠質瘤的發生發展。分析發現2組患者年齡、性別及腫瘤位置無統計學差異，而在腫瘤直徑、WHO分期、手術切除程度及血清miR-27b-3p水平方面存在統計學差異。多因素Cox回歸分析發現腫瘤直徑≥4.5 cm、WHO分級Ⅲ～Ⅳ級、手術未完全切除及miR-27b-3p 低表達是腦膠質瘤患者術后復發的獨立危險因素。究其原因，腫瘤直徑是腫瘤細胞數量最直接的體現，較大的腫瘤在密閉的顱腔內壓迫腦組織的可能性更高［32］，因此腫瘤直徑大的患者往往預后較差。WHO分級晚的患者提示其腫瘤惡性程度較高，因此術后患者的復發及轉移率也相對較高。手術未能完全切除腫瘤的患者術后容易在腫瘤原發部位復發，且腫瘤的殘余量是患者術后復發的影響因素之一。然而在臨床上，雖然接受全切手術的患者可能延緩了腫瘤的復發，但手術過程本身有可能對患者腦重要功能區造成損傷，進而對患者術后生活質量造成不良影響。因此，臨床上應盡量兼顧腫瘤的切除及患者腦神經功能區的保護［33］，以期在降低術后復發率的同時提高患者生活質量。

為探究miR-27b-3p影響腦膠質瘤患者術后復發的分子機制，我們分析了腦膠質瘤患者血清miR-27b-3p 水平與腫瘤直徑、WHO 分級及手術是否完全切除的關系，結果表明血清miR-27b-3p 低表達與較大的腫瘤直徑及較高的WHO分級顯著相關，這一結果提示miR-27b-3p可能通過調節腦膠質瘤進展及轉移影響患者預后。

ROC曲線分析結果顯示血清miR-27b-3p預測腦膠質瘤患者術后復發的AUC 為0.826，表明血清miR-27b-3p水平對膠質瘤患者術后復發具有較高的預測價值。當血清miR-27b-3p水平低于4.738時，腦膠質瘤患者術后復發的風險增加。

本研究存在一定的不足。首先，本研究納入的樣本量較少，且未能統計腦膠質瘤患者術后的生存率，結果可能存在一定的偏倚。此外，miR-27b-3p影響膠質瘤進展機制缺乏深入的研究，未來將探索miR-27b-3p下游的靶基因以進一步揭示其在腦膠質瘤進展中的作用機制。

腦膠質瘤組患者血清miR-27b-3p表達水平顯著低于顱腦損傷組。腫瘤直徑≥4.5 cm、WHO 分級Ⅲ～Ⅳ、手術未完全切除及miR-27b-3p 低表達是腦膠質瘤患者術后復發的獨立危險因素。血清miR-27b-3p水平對腦膠質瘤患者術后復發具有較高的預測價值。血清低水平的miR-27b-3p與較大的腫瘤直徑及較晚的腫瘤分期顯著相關，其可能通過影響膠質瘤的進展與轉移影響患者術后復發。