低聲壓次聲對血管性癡呆大鼠海馬功能保護(hù)作用的研究

陳翠銀 鄭碧娥 范建中 何任紅

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515

血管性癡呆是發(fā)生在腦血管疾病后的重度認(rèn)知障礙，其發(fā)病率高，病情遷延反復(fù)，預(yù)后往往不良［1-2］。研究顯示中國年齡＞60 歲人群中，血管性癡呆的發(fā)病率約每年2.4/1 000 人［3］，VD 患者的中位生存期縮短［4］。國內(nèi)的薈萃分析顯示，中國中老年社區(qū)人口中血管性癡呆的人群病死率高達(dá)14.6%［5］。VD的病理改變多樣［6］，可表現(xiàn)為皮質(zhì)梗死、皮層下梗死、腔隙性梗死、白質(zhì)病變等，尤其是海馬的病變在VD 過程中起重要作用，因此通過改善海馬功能是改善VD認(rèn)知功能的重要途徑［7-9］。

低聲壓次聲是指聲壓強(qiáng)度＜90 dB、在安全域內(nèi)的次聲，可以穿過顱骨，通過波動效應(yīng)作用于腦組織，筆者前期實驗證實低聲壓次聲可以縮小梗死灶面積，減少細(xì)胞凋亡，增加神經(jīng)元的可塑性，并促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞增殖［10-12］。目前尚無研究探討低聲壓次聲是否可促進(jìn)海馬區(qū)內(nèi)源性干細(xì)胞分化定向分化，從而改善VD認(rèn)知功能。本實驗探討低聲壓次聲在改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能中的作用，并分析此過程中海馬區(qū)神經(jīng)元的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：體質(zhì)量230～270 g 的雄性SD 大鼠，共24只，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級，實驗過程中飼料和飲水自由，干預(yù)時在特定實驗操作間完成，實驗全過程遵守動物福利與倫理原則，并受單位動物倫理委員會的監(jiān)督。

1.1.2 儀器和試劑：美國CHI 公司次聲治療儀Infrasound（8TM）；TSE 穿梭箱主動和被動逃避實驗系統(tǒng)）；日本尼康正置熒光顯微鏡和成像系統(tǒng)；Abcam兔多克隆Anti-beta ⅢTubulin 抗體，熒光二抗：FITC標(biāo)記，賽維爾山羊抗兔。

1.2 實驗方法將24只SD實驗大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、VD 組和次聲組各8 只。各組大鼠分別建模，VD組和次聲組大鼠行雙側(cè)頸總動脈閉塞手術(shù)，假手術(shù)組大鼠行假手術(shù)。

1.2.1 VD 模型建立：隔開3 d 先后結(jié)扎右側(cè)和左側(cè)頸總動脈，假手術(shù)切開手術(shù)部位并分離找到頸總動脈但不進(jìn)行結(jié)扎。使用水合氯醛（濃度10%，4 mL/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉，作頸部前正中線旁切口，游離肌肉找到頸動脈鞘，輕輕撥開迷走神經(jīng)，縫線結(jié)扎頸總動脈，縫合傷口，術(shù)中保持大鼠恒溫。通過比較假手術(shù)組和VD 組大鼠在被動躲避試驗的行為學(xué)表現(xiàn)評價是否建模成功［13］。

1.2.2 干預(yù)方法：VD 組大鼠無真實次聲干預(yù)，次聲組大鼠接受真實低聲壓次聲干預(yù)，假手術(shù)組大鼠不做任何處理，方法為術(shù)后24 h開始進(jìn)行干預(yù)，1次/d，60 min/次，為期7 d。次聲組接受干預(yù)的次聲頻率4～20 Hz，聲強(qiáng)79.75～86.11 dB。

1.2.3 被動躲避試驗：大鼠喜暗，會從明箱主動進(jìn)入暗箱，關(guān)門后電擊其足底，使大鼠產(chǎn)生被電擊的恐懼記憶，通過觀察大鼠進(jìn)入暗箱的遲疑，即步入潛伏期，來評估其認(rèn)知功能。在建模前，所有大鼠均需適應(yīng)性訓(xùn)練，保證其躲避潛伏期基本一致，然后再隨機(jī)分組。在實驗第7天對3組大鼠評估，先排除掉步入潛伏期超過100 s的大鼠；30 min后當(dāng)大鼠自主進(jìn)入暗箱后關(guān)門，接受1.0 mA、持續(xù)3 s 的電刺激，2 min后重復(fù)進(jìn)行。訓(xùn)練以大鼠拒絕進(jìn)入暗箱或留在明箱超過120 s或共接受了3次訓(xùn)練作為結(jié)束的標(biāo)準(zhǔn)。次日從明箱進(jìn)入的大鼠允許在明暗箱間自由活動，記錄步入潛伏期。

1.2.4 標(biāo)本制作：術(shù)后第7 天麻醉后剪開胸廓，先用250 mL生理鹽水從心尖輸入，右心耳流出，沖洗體內(nèi)血液，然后用多聚甲醛（濃度為4%，約200 mL）進(jìn)行灌注固定，后完整取出大鼠腦組織并浸泡固定24 h。后續(xù)進(jìn)行常規(guī)脫水、透明石蠟包埋，選取海馬區(qū)作片厚5 μm的連續(xù)冠狀切片備用。

1.2.5 免疫熒光染色：石蠟切片先行常規(guī)脫蠟，用EDTA 抗原修復(fù)緩沖液進(jìn)行5 min 熱修復(fù)抗原，冷卻至室溫后再使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）進(jìn)行每次5 min的漂洗，共3次；畫圈淬滅自發(fā)熒光，牛血清白蛋白封閉30 min，加βⅢ-tublin一抗4 ℃孵育過夜，PBS 漂洗，避光室溫加山羊抗兔二抗孵育50 min，PBS漂洗，避光室溫加DAPI染液孵育10 min，PBS 漂洗甩干后，再用抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片。以雙側(cè)海馬為圖像分析區(qū)域，熒光顯微鏡下采集圖像，每組取3個（×400）視野，用Image-pro plus 6.0進(jìn)行處理，計算βⅢ-tublin的累積光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計分析，LSD 法兩兩比較；不符合正態(tài)分布時，采用非參數(shù)檢驗方法分析。

2 結(jié)果

2.1 被動躲避試驗結(jié)果潛伏期越短代表認(rèn)知功能越差，VD組大鼠的步入潛伏期較假手術(shù)組顯著縮短（P＜0.05），表明VD模型建立成功；次聲組大鼠的步入潛伏期比VD 組顯著較長（P＜0.05），表明低聲壓次聲治療可以改善VD大鼠認(rèn)知功能；進(jìn)一步比較假手術(shù)組和次聲組間的步入潛伏期，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明低聲壓次聲可有效減緩的VD 嚴(yán)重程度。見表1。

表1 各組步入潛伏期比較 （s，±s）Table 1 Comparison of stepping latency in each group（s，±s）

表1 各組步入潛伏期比較 （s，±s）Table 1 Comparison of stepping latency in each group（s，±s）

組別假手術(shù)組癡呆組次聲組步入潛伏期237.20±125.65 45.04±36.51 144.50±83.90 F值P值9.169 0.001

2.2 βⅢ-tublin免疫熒光染色βⅢ-tublin是神經(jīng)元的標(biāo)記物之一，可反映新生神經(jīng)元的數(shù)量。與假手術(shù)組相比，VD組和次聲組大鼠在海馬齒狀回顆粒下區(qū)表達(dá)的βⅢ-tublin 顯著增加（P＜0.05），表明VD 發(fā)生后在海馬區(qū)會出現(xiàn)新生神經(jīng)元；次聲組大鼠在海馬齒狀回顆粒下區(qū)表達(dá)的βⅢ-tublin較VD組顯著增加（P＜0.05），表明低聲壓次聲可以增加海馬區(qū)神經(jīng)元的分化。見表2、圖1。

表2 各組βⅢ-tublin累積光密度比較 （±s）Table 2 Comparison of IOD of βⅢ-tublin in each group（±s）

表2 各組βⅢ-tublin累積光密度比較 （±s）Table 2 Comparison of IOD of βⅢ-tublin in each group（±s）

組別假手術(shù)組癡呆組次聲組IOD 864.01±62.51 1486.61±74.02 1677.64±73.89 F值P值146.302＜0.001

3 討論

隨著腦血管病發(fā)生率的增加，VD 患者逐漸增多，探索更多康復(fù)方法是VD 重要臨床需求，物理因子作為一種有效方法，已用于神經(jīng)疾病康復(fù)中，根據(jù)物理特性不同分為聲療、光療、電療、磁療等，次聲作為一種物理因子，是一種機(jī)械波，其頻率與人體器官固有振動頻率相當(dāng)，故易產(chǎn)生人體共振［14］，從而被用于疾病的康復(fù)。本研究通過探討低聲壓次聲在VD中的作用，發(fā)現(xiàn)其可以改善VD 認(rèn)知功能，并促進(jìn)了海馬區(qū)神經(jīng)元的生長。

血管閉塞導(dǎo)致持續(xù)性全腦低灌注可引起神經(jīng)元發(fā)生凋亡，腦實質(zhì)萎縮，造成隱性腦損傷［14］。腦血管損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化參與形成新的神經(jīng)線路，從而起到修復(fù)神經(jīng)功能的作用［16-17］。有研究在對SD大鼠的實驗中也得到類似的結(jié)論［18］，而且被逆轉(zhuǎn)錄病毒標(biāo)記的新生神經(jīng)元能夠有效發(fā)揮功能［8，19］。記憶的形成與海馬結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，有研究觀察到海馬依賴型記憶任務(wù)執(zhí)行效果的提高與海馬神經(jīng)發(fā)生增加有關(guān)［20-22］，提示促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生能夠改善血管性癡呆患者的記憶力。但內(nèi)源性的神經(jīng)發(fā)生非常有限［23-24］，若同時能夠配合有效的外源性手段，可提高神經(jīng)修復(fù)的效果。研究發(fā)現(xiàn)暴露于16 Hz 次聲的大鼠海馬中nestin 蛋白表達(dá)明顯增加，提示次聲可以刺激大鼠海馬內(nèi)源性干細(xì)胞增殖［25］。本實驗組前期研究發(fā)現(xiàn)對局灶性缺血大鼠進(jìn)行低聲壓次聲干預(yù)60 min/d，能改善其認(rèn)知功能，并觀察到在干預(yù)后的第7 天，就有內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖增加的表現(xiàn)。在神經(jīng)發(fā)生過程中，分化是其中重要且決定性的一步［26］，βⅢ-tublin（Tuj-1）在齒狀回新生神經(jīng)元中表達(dá)［27］，被用作成年神經(jīng)發(fā)生過程中新生神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物［28-30］。

本研究顯示，分步雙側(cè)頸總動脈閉塞模型建立后第7 天，大鼠即可出現(xiàn)記憶力下降的表現(xiàn)，而經(jīng)過低聲壓次聲干預(yù)的模型大鼠與未經(jīng)干預(yù)的模型大鼠相比，其記憶力損害得到一定的改善，提示低聲壓次聲對血管性癡呆大鼠的認(rèn)知功能能起到正向作用。同時從免疫熒光染色的結(jié)果中可以看出，持續(xù)腦灌注減低后大鼠海馬齒狀回顆粒下區(qū)的βⅢ-tublin 表達(dá)增加，提示內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞分化增加，而低聲壓次聲可以進(jìn)一步促進(jìn)這一過程的發(fā)生。但本實驗同時存在一定局限性，只觀察了術(shù)后7 d 的變化，而沒有進(jìn)行長期干預(yù)和動態(tài)觀察，下一步可繼續(xù)完善和補(bǔ)充這方面的研究。

低聲壓次聲對血管性癡呆有正向影響，這可能與促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞分化、改善海馬區(qū)神經(jīng)元功能有關(guān)，可作為VD臨床康復(fù)的一種潛在治療方法。