TGF-β/Smad通路在羊棲菜多糖誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用*

劉衛(wèi)紅 楊 晨 張貴平 張玉果

1.邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)科(河北 邯鄲, 056001) 2.邯鄲市中心醫(yī)院腫瘤科 3.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病科

肝癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤,大多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期,喪失了手術(shù)切除的最佳時(shí)機(jī),而采用放化療往往給患者帶來(lái)較大副作用。目前,靶向治療逐步成為治療肝癌的重要手段,因此深入闡明肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制具有深遠(yuǎn)意義[1]。羊棲菜多糖是從羊棲菜中提取出來(lái)的水溶性多糖,具有抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞免受氧化損傷的作用[2]。羊棲菜多糖通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和阻滯細(xì)胞周期可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡[3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族的一員,TGF-β1與肝癌密切相關(guān)。鱉甲煎丸可能通過(guò)減少由二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌大鼠組織中TGF-β1表達(dá)水平,抑制由TGF-β/Smad通路激活介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而達(dá)到抗肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移侵襲的作用[4]。水蘇堿通過(guò)抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路可阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[5]。由此可見(jiàn),TGF-β1/Smad信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞的惡性生物行為學(xué)中具有重要作用。本研究探討羊棲菜多糖是否能通過(guò)抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路從而發(fā)揮抗肝癌作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 試劑和儀器 羊棲菜多糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;培養(yǎng)基、胎牛血清以及青霉素和鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;CCK-8試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司;Transwell小室和基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、TGF-β1、p-Smad2、Smad2和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司;多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%鏈霉素和青霉素的培養(yǎng)基中,每2 d更換1次培養(yǎng)基,細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行傳代,取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞不同濃度羊棲菜多糖處理細(xì)胞(0、15、30和60 mg/L),另設(shè)空白孔作為調(diào)零孔,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 加入不同濃度羊棲菜多糖處理24 h后,棄掉原有培養(yǎng)基,加入含CCK-8溶液的培養(yǎng)基150 μl,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定隔空吸光度(A值),計(jì)算細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞,預(yù)冷PBS清洗3次,500 μl結(jié)合緩沖液將細(xì)胞重懸,再加入5 μl碘化丙啶和5 μl Annexin V-FITC,充分混勻,避光孵育15 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移和侵襲細(xì)胞數(shù) 在上室中鋪滿(mǎn)基質(zhì)膠,并加入5×104個(gè)細(xì)胞,下室中加入500 μl完全培養(yǎng)基,將小室置于培養(yǎng)箱中24 h,無(wú)菌濕棉簽輕輕擦去上室中多余細(xì)胞,經(jīng)甲醇固定,結(jié)晶紫染色后,顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.7 蛋白印跡法檢測(cè)各蛋白表達(dá) 棄掉培養(yǎng)基,預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞2次,裂解液裂解,BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度,120 V電泳2 h,0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h,洗膜,室溫封閉1 h,GAPDH、TGF-β1、p-Smad2、Smad2以及Bcl-2和Bax抗體(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,洗膜,顯色,Image J分析條帶灰度值,目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度羊棲菜多糖處理后細(xì)胞存活率及凋亡率比較見(jiàn)表1、圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度羊棲菜多糖處理后細(xì)胞凋亡情況 (A:0 mg/L組;B:15 mg/L組;C:30 mg/L組;D:60 mg/L組)

表1 不同濃度羊棲菜多糖處理后細(xì)胞存活率及凋亡率比較

2.2 不同濃度羊棲菜多糖處理后侵襲細(xì)胞數(shù)及遷移細(xì)胞數(shù)比較 見(jiàn)表2,圖2、3。

圖2 不同濃度羊棲菜多糖處理后侵襲細(xì)胞數(shù)

圖3 不同濃度羊棲菜多糖處理后遷移細(xì)胞數(shù)

圖4 細(xì)胞中各蛋白表達(dá)情況 (A:0 mg/L;B:15 mg/L;C:30 mg/L;D:60 mg/L)

表2 不同濃度羊棲菜多糖處理后侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)比較

2.3 蛋白相對(duì)表達(dá)量 見(jiàn)表4。

表4 不同濃度羊棲菜多糖處理后細(xì)胞中TGF-β1、p-Smad2、Smad2、Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

肝癌是我國(guó)第二位癌癥殺手,目前肝癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),且逐步趨于年輕化。早期肝癌一般采用外科手術(shù)切除、射頻消融、動(dòng)脈化療栓塞等,但是早期無(wú)明顯癥狀,因此多數(shù)患者錯(cuò)失了最佳治療手段,對(duì)于中晚期肝癌患者常采用綜合治療方案,抗腫瘤藥物的應(yīng)用可延緩肝癌的進(jìn)展,但是治療效果并不理想,患者仍出現(xiàn)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高、預(yù)后差、5年生存率不足等結(jié)果,因此亟待開(kāi)發(fā)治療肝癌的新型靶向藥物。

羊棲菜多糖具有多種藥理學(xué)活性,Wu等[6]研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜多糖通過(guò)修飾糖尿病小鼠腸道菌群和腸道代謝產(chǎn)物對(duì)緩解高糖引起的肝臟和心臟病理?yè)p傷具有改善作用。Chen等[7]研究表明羊棲菜多糖通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)、保護(hù)腸道屏障和調(diào)節(jié)腸道微生物可改善結(jié)腸炎。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜多糖可減輕高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗,從而減輕肝臟氧化應(yīng)激水平。體內(nèi)外研究均表明,羊棲菜多糖對(duì)肺癌具有抑制作用,主要是通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶家族和上皮鈣黏蛋白發(fā)揮作用[9]。羊棲菜多糖對(duì)卵巢上皮癌裸鼠移植瘤具有抑制作用[10]。本研究通過(guò)不同濃度羊棲菜多糖處理HepG2細(xì)胞,結(jié)果顯示細(xì)胞存活率隨著羊棲菜多糖濃度的升高而降低,細(xì)胞凋亡率隨羊棲菜多糖濃度的升高而升高。由此可見(jiàn),羊棲菜多糖可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,抑制肝癌細(xì)胞增殖。細(xì)胞遷移和侵襲是惡性腫瘤患者死亡的主要原因,因此本研究探討了羊棲菜多糖對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著羊棲菜多糖濃度的升高,肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力降低。以上結(jié)果表明,羊棲菜多糖可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

TGF-β信號(hào)通路是一條跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中起到調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的作用,TGF-β超家族信號(hào)通路與多種疾病密切相關(guān),包括癌癥、器官纖維化以及自身免疫病等[11]。TGF-β家族成員可直接激活下游Smad信號(hào)通路,TGF-β激活后可活化下游Smad2,通過(guò)與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物,Smads復(fù)合物從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi),再結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行基因調(diào)控,在癌癥晚期,TGF-β/Smad信號(hào)通路由于主要蛋白出現(xiàn)了基因缺失和突變,導(dǎo)致該通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常,從而導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[12]。研究發(fā)現(xiàn),小檗堿可能通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路,干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞的上皮間質(zhì)進(jìn)程,抑制HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲能力[13]。Li等[14]研究表明KLF2通過(guò)降低TGF-β1和Smad的活性可抑制肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性。因此本研究檢測(cè)了細(xì)胞中TGFβ-1和Smad2的活性,結(jié)果顯示隨羊棲菜多糖濃度的升高,TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)降低。說(shuō)明羊棲菜多糖可抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路。細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,受多種基因的調(diào)控,Bax和Bcl-2是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因[15,16]。本研究結(jié)果顯示,隨羊棲菜多糖濃度的升高,Bax蛋白表達(dá)升高,Bcl-2蛋白表達(dá)降低。由此說(shuō)明羊棲菜多糖促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述,羊棲菜多糖可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,其可能是通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路激活發(fā)揮作用,但本研究仍存在不足,首先僅在細(xì)胞水平上進(jìn)行探討,下一步將通過(guò)肝癌移植瘤進(jìn)一步深入探討羊棲菜多糖對(duì)肝癌的影響。另一方面,本研究通過(guò)檢測(cè)TGF-β/Smad信號(hào)通路中主要相關(guān)蛋白說(shuō)明羊棲菜多糖可能是通過(guò)調(diào)節(jié)該信號(hào)通路發(fā)揮作用,缺乏一定的有力證據(jù),下一步將通過(guò)激活該信號(hào)通路,探討羊棲菜多糖對(duì)該信號(hào)通路的調(diào)控作用。