和木化癥湯抗肝癌關(guān)鍵成分及其免疫調(diào)節(jié)機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析*

莊麗萍 陳春燕 劉 榮 陳曉蓉 楊宗國

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科 (上海, 200032) 2.上海市公共衛(wèi)生臨床中心藥學(xué)部 3.上海市公共衛(wèi)生臨床中心中西醫(yī)結(jié)合科

原發(fā)性肝癌是我國目前第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因,近年來,基于免疫節(jié)點抑制劑的聯(lián)合治療為中晚期肝癌患者帶來了新的曙光,總體客觀緩解率為20%～30%[1]。越來越多的研究表明,中醫(yī)藥在肝癌的防治方面展現(xiàn)了其獨特的優(yōu)勢,在改善肝癌患者的生存質(zhì)量、增強免疫力、延長生命等方面有著顯著療效[2,3]。根據(jù)肝癌病理變化和臨床表現(xiàn),本病屬于中醫(yī)學(xué)“癥瘕”“積聚”范疇,其基本病機為正虛邪盛,瘀阻肝絡(luò);邪毒久稽,肝絡(luò)受損,氣滯血瘀。所謂“久病入血”“久病入絡(luò)”,血絡(luò)瘀阻為積之體,肝絡(luò)失和為癥之用,從瘀論治、調(diào)和肝絡(luò)是緊扣其病機關(guān)鍵的治則治法。和木化癥湯是本團隊在《金匱要略》下瘀血湯基礎(chǔ)上,根據(jù)中醫(yī)辨證理論化裁而成,由大黃、桃仁、蟲、柴胡、黃芩、牡蠣組成,用于治療肝癌患者取得了很好的臨床療效?！对l(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》中推薦使用下瘀血湯治療血瘀證肝癌患者[4]。下瘀血湯加減治療原發(fā)性肝癌肝熱血瘀證行經(jīng)皮肝動脈化療栓塞(TACE)術(shù)后患者,可有效改善其中醫(yī)癥候,降低血清基質(zhì)金屬蛋白酶水平,改善肝功能及生活質(zhì)量[5]。體內(nèi)外實驗均表明,下瘀血湯可抑制肝癌細胞增殖,誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡[6,7]。然而,下瘀血湯原文主治婦人產(chǎn)后瘀血內(nèi)停致少腹疼痛,缺乏治療肝癌的引經(jīng)藥物。柴胡、黃芩為小柴胡湯的關(guān)鍵藥對,主治“脅下滿痛”。柴胡善疏散少陽半表半里之邪,使邪氣外達,解表而和里;黃芩善清肝膽氣分之熱,使半里之邪內(nèi)徹,二藥可調(diào)肝膽之氣機,清內(nèi)蘊之濕熱。《湯液本草》中指出“牡蠣,咸為軟堅之劑,以柴胡引之,能去脅下之硬”。和木化癥湯以柴胡、黃芩、牡蠣引專治婦人血瘀證之下瘀血湯入肝經(jīng),緊扣肝癌之瘀阻血絡(luò)病機,配伍得當,方證相合,具有較好的潛在研究價值。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,從“成分-靶點-通路”角度探討和木化癥湯抗肝癌的關(guān)鍵成分及其免疫調(diào)節(jié)機制,為該中藥復(fù)方的理論研究及臨床應(yīng)用提供思路與依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分靶點篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索大黃、桃仁、柴胡、黃芩的化合物成分和靶點,成分篩選條件為口服利用度(OB)≥30%,藥物類似性(DL)≥0.18。其中,由于TCMSP數(shù)據(jù)庫未收錄牡蠣和土鱉蟲,因此,二者的化合物成分從Batman-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)進行補充,選取得分>20分的成分靶點納入。所有靶點經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)校正,輸入蛋白名稱并限定物種為“Homo sapiens”,去掉非人類靶點。

1.2 藥物-疾病靶點(DDT)網(wǎng)絡(luò)可視化分析 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),NCBI基因數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以及DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/),以“Liver Cancer”為關(guān)鍵詞,檢索肝癌相關(guān)的人類基因。其中GeneCards數(shù)據(jù)庫所獲得的靶點將得分基于中位值進行篩選以獲得更加相關(guān)的靶點。利用Venny 2.1平臺篩選藥物靶點與疾病靶點的共同蛋白,所得交集即為DDT。將DDT納入Cytoscape 3.8.0軟件進行DDT的網(wǎng)絡(luò)可視化分析展示。通過NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 將藥物疾病共有靶點DDT輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens” ,最低互動分數(shù)為0.9。利用Cytoscape 3.8.0軟件進行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.4 關(guān)鍵成分篩選 將藥物成分、疾病及作用靶點納入Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。按照藥物成分度值排序,篩選度值大于平均度值的成分為關(guān)鍵成分。

1.5 免疫功能富集分析 將藥物疾病共有靶點DDT進行GO生物過程(BP)、分子功能(MF)、細胞組分(CC)及KEGG信號通路富集分析,引用STRING數(shù)據(jù)庫,將校正P<0.05的項目按照免疫相關(guān)關(guān)鍵詞進行篩選,具體包括“T cell”“B cell”“Natural killer cell”“Th1”“Th2”“Th17”“Fc”“TNF”“IL-17”“chemokine”“cytokine”“PD-1”及“immune”等。利用imageGP平臺將富集結(jié)果進行可視化分析[8]。

2 結(jié)果

2.1 和木化癥湯關(guān)鍵成分 通過TCMSP及Batman-TCM數(shù)據(jù)庫篩選和木化癥湯組方成分的靶點,經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫人類靶點校正,匯總刪重后,柴胡獲得16個化合物成分,179個靶點;大黃獲得16個化合物成分,68個靶點;黃芩獲得36個化合物成分,120個靶點;桃仁獲得45個化合物成分,50個靶點;牡蠣獲得5個化合物成分,27個靶點;土鱉蟲獲得1個化合物成分,32個靶點。

通過GeneCards、NCBI及DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索肝癌靶點。其中GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得4 230個相關(guān)靶點;NCBI數(shù)據(jù)庫獲得719個相關(guān)靶點;DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲得1 395個相關(guān)靶點。將這3個數(shù)據(jù)庫的基因合并刪重之后,得到4 883個肝癌相關(guān)基因。

將篩選出的藥物靶點與疾病靶點輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1,得到197個共有靶點(圖1A)。將共有靶點構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò),見圖2B,該網(wǎng)絡(luò)中有197個節(jié)點,693條邊,平均度值為7.07。其中核心靶點為MAPK1、AKT1、HSP90AA1、JUN、RELA、ESR1、FOS、MAPK14、IL6及RXRA等。

圖1 和木化癥湯與肝癌的共有靶點及其PPI網(wǎng)絡(luò)

圖2 成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.2 成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化 為了更好理解成分、疾病以及相應(yīng)靶點之間的復(fù)雜作用關(guān)系,我們以納入的成分、治療疾病以及作用靶點為基礎(chǔ),通過Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建了成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。

2.3 和木化癥湯關(guān)鍵成分篩選 將成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖,導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中進行拓撲分析。將成分進行度值的排序,度值越高成分越重要。取大于平均度值(12)的成分作為關(guān)鍵成分(表1)。和木化癥湯與肝癌相關(guān)度較大的核心成分是quercetin(槲皮素)、kaempferol(山柰酚)、wogonin(漢黃芩)、baicalein(黃芩素)、isorhamnetin(異鼠李素)及betA-sitosterol(β-谷甾醇)等。

表1 和木化癥湯關(guān)鍵成分基本信息

2.4 GO功能富集 將和木化癥湯和肝癌的197個共有靶點納入STRING數(shù)據(jù)庫進行GO的BP、MF、CC富集,以校正P<0.05及錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05為標準,共得到2 234條生物過程,158項MF相關(guān)的注釋,64項CC組成相關(guān)的注釋。通過T cell、B cell關(guān)鍵詞篩選,共得到49條BP注釋。如圖3所示,和木化癥湯主要參與肝癌T細胞及B細胞的活化、增殖、分化、遷移、自穩(wěn)、凋亡及其調(diào)控過程。

2.5 KEGG信號通路 將和木化癥湯和肝癌的197個共有靶點納入STRING數(shù)據(jù)庫進行KEGG信號通路富集,以校正P<0.05及錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05為標準,共得到166條注釋。通過免疫關(guān)鍵詞篩選,共得到13條KEGG信號通路(圖4)?？梢钥闯?和木化癥湯及肝癌的共有靶點主要富集于IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、Th17 cell differ-entiation、Chemokine signaling pathway、T cell receptor signaling pathway等免疫相關(guān)信號通路。

圖4 和木化癥湯及肝癌共有靶點的KEGG信號通路富集(免疫相關(guān))

3 討論

在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中,“郁、濕、熱、瘀”是其最主要的病理因素。肝郁氣滯是發(fā)病的起始,濕、熱、瘀膠結(jié)是發(fā)病的要點[9]?！妒備洝しe聚門》中指出:“牢固推之不移者癥也”?！镀嫘Я挤健分嘘P(guān)于“積”的成因認為:“氣上逆,則六腑不通,但氣不行,凝血蘊里不散,津液凝澀不去而成積矣”?！兜は姆ā分兄赋觥皻庋獩_和,百病不生。一有怫郁,諸病生焉,故人身諸病多生于郁”。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中,氣機郁滯促進了“濕、熱、瘀”等病理因素的形成,有形之邪相互膠著,附著于肝絡(luò),日久成積[9]。同時,少陽樞機不利是肝癌發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[10]。因此,肝癌的治療應(yīng)以理氣解郁、和解少陽為關(guān)鍵,清熱化濕、活血化瘀為要點。和木化癥湯以下瘀血湯為底,加用小柴胡湯中善治少陽的經(jīng)典藥對柴胡、黃芩,輔以牡蠣“結(jié)者散之”,軟堅散結(jié)。下瘀血湯廣泛應(yīng)用于肝硬化、肝癌的治療[4]?！督饏T玉函經(jīng)二注》曰:“血之干燥凝著者,非潤燥蕩滌不能去也。芍藥、枳實不能治,須用大黃蕩逐之,桃仁潤燥,緩中破結(jié),蟲下血”。簡而言之,下瘀血湯中用大黃入血分,蕩熱逐瘀,推陳致新;桃仁活血化瘀潤燥;土鱉蟲善攻干血,破結(jié)逐瘀。柴胡味辛苦而性微寒,入肝膽經(jīng),可疏利氣機之郁滯,《神農(nóng)本草經(jīng)》言其有“推陳致新”之效;黃芩苦寒,可清瀉少陽之濕熱。此二藥合用,起和解少陽的主導(dǎo)作用,清泄并施,疏利三焦,調(diào)達上下,宣通內(nèi)外[11]。綜上,和木化癥湯全方共奏和解少陽、疏利肝郁、祛瘀通絡(luò)、軟堅散結(jié)之功效。

我們利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對和木化癥湯治療肝癌的作用成分-靶點-通路做了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該方與肝癌相關(guān)度較大的核心成分是quercetin(槲皮素)、kaempferol(山柰酚)、wogonin(漢黃芩)、baicalein(黃芩素)、isorhamnetin(異鼠李素)及beta-sitosterol(β-谷甾醇)等。多項研究表明,槲皮素能顯著抑制肝癌細胞增殖,誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡,且與肝癌治療核心靶點有較好的結(jié)合能力[12,13]。山奈酚可提高肝癌細胞Caspase-3活性及細胞自噬能力,誘導(dǎo)細胞凋亡[14,15]。

漢黃芩及黃芩素均為黃芩的有效成分,漢黃芩可抑制肝癌細胞增殖、遷移及侵襲能力,改變細胞周期,促進細胞凋亡[16,17];黃芩素可調(diào)控肝癌細胞糖酵解及谷氨酰胺代謝,抑制微小RNA-130a(miR-130a)誘導(dǎo)的CANP-MMP-9通路激活,抑制肝癌細胞能量代謝及侵襲能力[18,19]。異鼠李素對人肝癌細胞增殖能力有顯著抑制作用,可阻滯肝癌細胞周期,誘導(dǎo)細胞凋亡[20]。作為和木化癥湯各組分的共有活性成分,β-谷甾醇對正常肝細胞的生長及凋亡蛋白幾乎沒有影響,而劑量依賴性地抑制肝癌細胞的生長,通過線粒體途徑及膜死亡受體途徑誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡[21,22]。

肝癌發(fā)生機制復(fù)雜,其中免疫調(diào)節(jié)機制成為肝癌治療的熱點及關(guān)鍵點[23,24]。中藥可通過調(diào)節(jié)肝癌患者的免疫功能,對抑制腫瘤生長、防止腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、提高生命質(zhì)量、延長生存期等均方面發(fā)揮了重要作用[25]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),和木化癥湯治療肝癌的核心靶點為MAPK1、AKT1、HSP90AA1、JUN、RELA、ESR1、FOS、MAPK14、IL6及RXRA等。其主要參與肝癌T細胞及B細胞的活化、增殖、分化、遷移、自穩(wěn)、凋亡及其調(diào)控過程,并涉及參與IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、Th17 cell differentiation及Chemokine signaling pathway等信號通路。研究表明,肝癌患者外周血中CD4+T細胞、CD4+/CD8+比值顯著低于健康受試者,而調(diào)節(jié)性T細胞、Th17及Tc17細胞水平顯著高于健康受試者[26]。B細胞可識別腫瘤抗原,發(fā)生活化,從而促進腫瘤特異性濾泡輔助性CD4+T細胞的增殖和分化,增強抗腫瘤CD8+T細胞反應(yīng)[27]。B細胞豐度的增加可顯著增強T細胞抗腫瘤免疫反應(yīng)[28]。IL-17、TNF、Th17作為促腫瘤細胞因子,調(diào)控炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng),促進肝癌發(fā)生發(fā)展[29-31]。另外,趨化因子信號通路在促腫瘤微環(huán)境的建立及肝癌進展中發(fā)揮重要作用,可作為抗肝癌藥物靶點[32]。因此,和木化癥湯對T細胞、B細胞及免疫相關(guān)信號通路的調(diào)控可能是其發(fā)揮抗肝癌效應(yīng)的分子機制。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法,初步探討了和木化癥湯抗肝癌的有效成分、核心靶點及免疫調(diào)節(jié)機制,為本復(fù)方的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供了一定的思路與依據(jù)。雖然利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中藥復(fù)方成分-靶點-通路的技術(shù)日益成熟,但該方法只作為一般性預(yù)測,其結(jié)果可靠性仍需要進一步論證。本研究僅局限于公共數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析,后續(xù)研究應(yīng)對和木化癥湯抗肝癌活性成分及免疫調(diào)節(jié)機制進行實驗驗證。