壞死性凋亡經典通路在心血管疾病中的研究進展

李唯嘉,榮書玲,李 保

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是全球重大的公共健康問題[1]。CVD的病理過程涉及多種細胞死亡形式,在受到非致死性應激或損傷時,心肌細胞主要發生程序性心肌細胞死亡[2]。程序性細胞死亡作為一種由基因決定的有序、主動死亡,包括凋亡、焦亡、鐵死亡和壞死性凋亡(necroptosis)。壞死性凋亡參與了多種CVD的發病過程,在動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)、心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷、心肌梗死(myocardial infarction,MI)、病理性心室重塑和心力衰竭(heart failure,HF)中發揮重要作用。近年來,壞死性凋亡的信號通路、相關分子機制研究也取得了重要進展。

壞死性凋亡是非半胱天冬氨酸酶(Caspase)依賴的可調控性細胞壞死,具有細胞凋亡和壞死的一些共同特征,主要表現為細胞腫脹和細胞膜完整性的破壞,可引起炎癥反應[3]。壞死性凋亡由死亡受體介導,被與受體相結合的配體激活,其中,參與腫瘤壞死因子-α/腫瘤壞死因子受體(TNF-α/TNFR)誘導途徑的蛋白如受體相互作用激酶1(receptor interacting protein-1,RIP1)、受體相互作用激酶3(receptor interacting protein-3,RIP3)和底物混合譜系激酶樣蛋白(mixed lineage kinase-like domain,MLKL)等是壞死性凋亡的關鍵分子,RIP1-RIP3-MLKL通路也被稱為壞死凋亡的經典通路,許多藥物和化合物通過作用于RIP1、RIP3、MLKL等壞死性凋亡關鍵分子抑制程序性壞死的發生[4]。

因此,明確心肌細胞壞死性凋亡的分子機制,探究壞死性凋亡在CVD的病理生理過程中的作用,對于尋找新的干預方式及治療靶點,有效降低CVD的死亡率,改善心血管病人的預后,具有重要的臨床意義。本研究針對壞死性凋亡的經典信號通路RIP1-RIP3-MLKL、抗壞死性凋亡相關治療藥物及這一通路在CVD中的研究進展進行綜述。

1 壞死性凋亡的經典信號通路及其在CVD中的作用

1.1 RIPs是壞死性凋亡中的重要調控分子

RIPs是一類具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的蛋白。在結構上,這類蛋白N端具有高度保守的激酶結構域,因此RIPs具有相同的生物學功能。RIPs可以接受細胞表面受體傳遞的細胞外刺激及來自細胞內模式識別受體的信號,啟動下游級聯反應,激活轉錄因子,而其中一些因子被激活后可以協助死亡信號的轉導,導致細胞死亡[5]。RIP蛋白家族具有許多成員,包括RIP1～7,其中RIP1和RIP3兩種蛋白在壞死性凋亡中有重要作用。

1.2 壞死性凋亡的經典通路

壞死性凋亡由死亡受體誘導發生,包括TNFR家族(如TNFR1、TNFR2、TRAILR、Fas/CD95)、病原體識別受體[如Toll樣受體(TLR)3、TLR4,NOD樣受體]、干擾素受體(IFNR)、干擾素調節因子(DAI)的DNA依賴性激活劑以及細胞內的RNA或DNA感受器等[6]。這些死亡受體與其各自的配體結合,啟動壞死性凋亡途徑。壞死性凋亡涉及多種信號通路,其中研究最為廣泛、最經典的是由TNF-α/TNFR途徑誘導的RIP1-RIP3-MLKL通路,該過程可以被簡述為:當TNF-α與TNFR1結合,TNFR1被激活后與RIP1、腫瘤壞死因子受體相關死亡域蛋白(TRADD)、FADD/E3泛素化連接酶、TRAF2/5、細胞凋亡蛋白-1的細胞抑制劑cIAP1/2共同形成復合物I,RIP1在此過程中泛素化,活性受到抑制,NF-κB通路被激活,利于細胞生存。復合體I中的RIP1去泛素化后被激活并從中解離,在胞漿中招募Csapase-8(外源性凋亡途徑的啟動因子,當被抑制或敲除時激活壞死性凋亡)等。當三磷酸腺苷(ATP)充足時,Caspase-8活化,此時RIP1和RIP3失活,阻斷壞死性凋亡通路,同時凋亡通路被激活,最終導致細胞凋亡;當ATP缺乏時,Caspase-8活性減低,RIP3和RIP1結合,形成RIP1-RIP3復合物招募并磷酸化下游的MLKL;活化的MLKL與磷脂酰肌醇磷酸鹽、磷脂酰甘油和心磷脂結合,形成壞死性復合體,并易位到細胞膜,其中的MLKL引起細胞膜透化、細胞腫脹,細胞釋放內源性危險信號損傷相關分子模式,啟動免疫應答,導致炎癥反應發生[7]。

此外,隨著研究的不斷深入,除了TNF-α介導的經典壞死性凋亡外,RIP1和RIP3可以激活線粒體應激通路介導壞死性凋亡的發生,如RIP1介導的RIP1-MEK/ERK通路,RIP3介導RIP3-c-Jun氨基末端激酶(JNK)-BNIP3、RIP3-PGAM5-Drp-1、RIP3-鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)-線粒體膜通透性轉換孔(mPTP)通路等[8]。研究發現,CaMKⅡ可能作為MLKL的下游效應因子,并參與了心肌I/R損傷過程中的壞死性凋亡[9]。RIP3還可以激活內質網應激通路介導壞死性凋亡發生,如RIP3-XO-活性氧(ROS)-mPTP信號通路[10]。但是這些信號轉導分子機制目前并未完全闡明,仍需要深入研究。

2 抗壞死性凋亡藥物在心肌損傷治療中的作用

2.1 RIP1抑制劑

壞死抑素-1(necrostatin-1,Nec-1)是發現最早、應用最廣泛的一種RIP1特異性抑制劑[11]。Nec-1已經廣泛應用于RIP1參與的各種細胞壞死和疾病[12]。Nec-1通過阻斷RIP1磷酸化有效地阻斷RIP1-RIP3-MLKL信號轉導,從而抑制細胞發生壞死性凋亡。在許多疾病模型中,如MI、精神疾病和腸道炎性疾病等,Nec-1被證實不僅抑制RIP1,還能降低RIP3的表達和磷酸化[13]。然而,Nec-1并不是直接抑制RIP3且不會阻斷RIP3自磷酸化,而是通過減少RIP1和RIP3之間的相互作用,抑制RIP1-RIP3復合體的形成和降低復合體穩定性,從而影響下游RIP3的活性[14]。

研究證實,ROS的產生可能是RIP1依賴性的,ROS增加RIP1/RIP3的表達,并能增強RIP1-RIP3復合體的穩定性;Nec-1還通過靶向ROS影響壞死性凋亡;在急性I/R損傷疾病模型中,Nec-1可以降低損傷細胞內ROS水平,這種下調甚至可以將損傷細胞ROS降至與正常細胞相似的ROS水平[15]。因此,Nec-1被廣泛應用于MI、AS、糖尿病心肌病等。除了Nec-1,Harris等[16]還在化學篩選中發現了其他幾種RIP1抑制劑,如GSK2982772,但尚在臨床試驗階段,其藥理機制有待深入研究。

2.2 RIP3抑制劑

RIP3作為RIP1的下游信號分子,直接靶向作用于MLKL,在整個信號通路中非常重要。因此,與RIP1激酶抑制劑相比,RIP3激酶抑制劑在壞死性凋亡中的作用更為重要。Li等[17]研究發現,一類傳統上用于治療轉移性黑色素瘤的B-Taf抑制劑(VE600)在抑制RIP3方面也有一定的效果,其中,一類化合物如達拉非尼通過競爭性抑制ATP與RIP3酶相結合,減少RIP3介導的MLKL磷酸化,破壞RIP3和MLKL之間的相互作用,但是目前尚未應用于CVD研究[18]。還有一些抗癌藥物如帕納替尼可以同時抑制RIP1和RIP3抑制壞死性凋亡。

2.3 MLKL抑制劑

MLKL可以作為預防細胞壞死性凋亡、抑制壞死性凋亡后嚴重的炎癥反應的最佳治療靶點,但是針對MLKL抑制劑的報道較少。壞死磺胺是MLKL抑制劑,目前仍應用于動物或細胞模型中。除了抑制經典通路的藥物,還有一些如褪黑素可以減少MI面積,其機制可能是通過抑制RIPK3-PGAM5-CypD-mPTP信號通路,減少mPTP的開放,抑制心臟I/R損傷后心臟微血管內皮細胞壞死性凋亡[19]。

隨著對壞死性凋亡藥物研究的不斷深入,一些藥物如達拉非尼等可用于治療特定臨床疾病。然而,大多數研究靶向壞死性凋亡的藥物及治療效果都僅停留在體外實驗或動物模型階段。因此,這些化合物和藥物臨床使用可行性仍有待進行體內試驗和臨床試驗評估。

3 壞死性凋亡與CVD的關系

3.1 壞死性凋亡與AS

AS累及大中肌性動脈,AS斑塊造成動脈壁增厚變硬、血管狹窄,不穩定斑塊破裂堵塞器官或四肢血管管腔,引發心腦血管疾病及并發癥。AS與脂質代謝密切相關,在血脂異常的因素中最重要的是過量的低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol,LDL),尤其是氧化型LDL(ox-LDL),氧化應激(oxidative stress,OS)可以加速LDL沉積在動脈內膜。LDL在ROS的作用下成為ox-LDL,ox-LDL刺激血管內皮細胞分泌炎性因子,誘導單核細胞與內皮細胞黏附,單核細胞轉化成巨噬細胞。ox-LDL還可以誘導巨噬細胞攝取脂蛋白,形成巨噬泡沫細胞,而巨噬細胞死亡是AS斑塊形成壞死的主要因素,壞死的斑塊容易破裂[20]。過去的研究多集中于ox-LDL有細胞毒性并能誘導平滑肌細胞和巨噬細胞的凋亡及凋亡細胞過早清除引起的繼發性壞死。近年來,關于在AS斑塊形成的過程中,巨噬細胞在壞死性凋亡中的作用也取得了一些進展。

目前研究認為,巨噬細胞壞死性凋亡途徑可以作為不穩定動脈粥樣硬化斑塊診斷和治療的靶點。研究顯示,在AS小鼠模型中,敲除RIP3基因的小鼠較對照組小鼠動脈粥樣斑塊的體積明顯縮小,病灶中壞死性凋亡的巨噬細胞較少,炎癥較輕,但是凋亡細胞的數量無明顯差異;進一步研究發現,RIP3和載脂蛋白E雙基因敲除的小鼠,動脈粥樣硬化斑塊中炎癥反應及壞死性凋亡水平明顯下降[21]。Karunakaran等[22]研究表明,AS病人的頸動脈斑塊巨噬細胞中RIP3和MLKL的表達顯著增加,并且檢測到磷酸化的MLKL,提示RIP3、MLKL與AS密切相關,且壞死性凋亡的激活及RIP3、MLKL基因表達上調可能增加斑塊的不穩定性,從而參與AS的病理過程,提早干預RIP3基因表達,可能會阻斷AS的病理進程;通過使用開發的新型Nec-1放射性示蹤劑,可以特異性定位于小鼠的AS斑塊,提示Nec-1靶向治療AS的壞死性凋亡可能是一種有效的策略。然而,有研究表明,MLKL基因敲除后,小鼠血中膽固醇水平降低,但增加了AS斑塊內和體外巨噬細胞源性泡沫細胞中脂質的累積,這可能是由于內體運輸缺陷導致的,目前尚無定論[23]。

3.2 壞死性凋亡與MI

MI是指冠狀動脈受到持續且嚴重的閉塞,心肌細胞持續性缺血缺氧,發生不可逆的死亡。而挽救缺血心肌的唯一方式是恢復血液灌注,即在冠狀動脈部分或完全梗死后一定時間內血液再次灌流,缺血的心肌雖然供血得以恢復,但心肌細胞壞死仍不可避免,超過一段時間再進行灌注會導致額外的不可逆損傷,加重梗死過程(致死性再灌注損傷)。在離體大鼠I/R模型中,使用Nec-1可以有效減小MI面積,改善心功能[24]。因此,深入研究壞死性凋亡的發生和調控對防治I/R及MI意義重大。研究表明,I/R后,小鼠心臟標本中RIP1、RIP3、MLKL的蛋白水平明顯升高;小鼠的非再灌注MI模型中RIP3也顯著上調。在RIP3基因敲除小鼠永久性左前降支結扎術,I/R后檢測小鼠心臟中RIP3顯著上調,ROS和其他炎癥反應也升高,在梗死3 d后左室射血分數升高,心肌肥大被抑制,提示RIP3介導MI后的不良重塑[25]。RIP1-RIP3-MLKL在MI病理生理過程及預后中發揮重要作用。

然而,隨著研究的深入,Chang等[26]研究顯示,MLKL在RIP3誘導的I/R壞死性凋亡中作用有限,提示還存在其他非經典通路參與這一過程。在高糖誘導的急性MI模型中,蛋白磷酸酶抑制劑可以通過抑制RIP3-CaMKⅡ介導的ROS,減輕壞死性凋亡。Zhang等[27]研究顯示,在大鼠心肌I/R損傷模型中,RIP3通過直接激活CaMKⅡ,引起mPTP開放,細胞內Ca2+濃度升高,促使心肌細胞壞死,這一過程與RIP1、MLKL無關,但此研究存在一定局限性。Yang等[28]研究顯示,MLKL和CaMKⅡ均參與RIP3誘發的心肌缺血引起的慢性胸痛,心肌I/R損傷可以由RIP1-RIP3-MLKL和RIP3-CaMKⅡ這兩條途徑共同參與,其中,CaMKⅡ被確定為RIP3的新型底物,在未來的研究中更具有價值。此外,還有幾種microRNA(miRNAs)也可以調節心臟I/R后的壞死性凋亡。miR-223被認為是I/R損傷和心肌壞死性凋亡的潛在調節因子,可以減小梗死面積及壞死標志物的生成;miRNAs調節受到RIP1、RIP3、MLKL蛋白水平的影響;miR-873作用機制與miR-223相同,都是壞死性凋亡的負性調節因子;miR-103、miR-107s可以促進壞死性凋亡,詳細機制有待進一步研究[29]。這些miRNAs可能作為減輕I/R損傷的新靶點,有助于治療缺血和OS誘導的心肌損傷,減輕I/R損傷,為治療MI、改善病人預后提供新的思路。

3.3 壞死性凋亡與HF

HF指在各種病因的作用下,由于心肌能量代謝、興奮收縮耦聯以及心臟結構發生變化,心排血量下降,啟動心率加快、心臟緊張源性加強、心肌收縮增強和心室重塑等心臟本身結構和功能、心外多種代償機制。長期代償導致心室重塑的發展進一步加重HF。

壞死性凋亡參與HF過程,并且促進心室重塑進程。Szobi等[30]研究發現,在HF病人的樣本中,壞死性凋亡的關鍵介質RIP1、RIP3和MLKL及其磷酸化水平表達較健康對照組均上調,活化的Caspase-8表達顯著下降,說明在HF過程中凋亡可能被抑制,促進壞死性凋亡的發生。阿霉素可以誘導心臟損傷,經阿霉素誘導的HF模型中RIP3表達上調,敲除RIP3基因可以減輕阿霉素對心臟的損害,減少MI后30 d的心功能障礙、心肌肥厚和炎癥反應,提示壞死性凋亡促進慢性HF的心室重塑;在橫向主動脈收縮(transverse aortic contraction,TAC)術后,小鼠在第8周出現HF,在衰竭的心臟標本中也可以觀察到類似的壞死性凋亡相關蛋白上調,表明壞死性凋亡促進TAC小鼠HF發展[31]。TAC后的RIP1、RIP3、MLKL及其磷酸化水平表達上調可以被分子伴侶熱休克蛋白(heat shock protein,Hsp)90抑制劑逆轉,Hsp90抑制劑也可通過抑制RIP1-RIP3-MLKL相互作用來減弱TNF-α誘導的壞死性凋亡,提示抑制Hsp90可能通過抑制受損心臟RIP1-RIP3-MLKL通路激活,從而產生治療效果[32]。

此外,RIP1、RIP3也可以作為潛在的新治療靶點,保護心臟免受兒茶酚胺超負荷引起的心臟損害[33]。Hippo信號效應子TEAD1[34]、硫化氫[35]通過抑制RIP1-RIP3-MLKL介導的壞死性凋亡成為HF的潛在治療靶點。

3.4 壞死性凋亡與心肌炎癥性疾病

壞死性凋亡可以引起嚴重的炎癥反應,心肌炎是心臟的炎癥性疾病。在病毒性心肌炎肌細胞損傷炎癥反應過程中產生大量炎性因子,其中包括TNF-α,這可能與柯薩奇病毒B3誘導細胞裂解和壞死性凋亡具有一定的相似性。Zhou等[36]提出壞死性凋亡可能是急性心肌炎心肌細胞死亡的新機制。急性病毒性心肌炎小鼠模型中,Nec-1明顯對小鼠心肌損傷起到保護作用[37]。

4 小 結

TNF-α介導的RIP1-RIP3-MLKL經典壞死性凋亡通路與CVD的發生發展密切相關。靶向調控這些壞死性凋亡相關的因子也為治療CVD指明了方向。然而,目前很多研究尚在細胞模型或動物模型階段,尚需深入研究并將這些發現轉化為臨床具有重要意義。