乳酰-N-新四糖的生物合成菌株構建及發酵條件研究

駱葉姣,胡苗苗,李夢麗,張濤

(食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇 無錫,214122)

人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)由于對嬰幼兒具有獨特營養功能而被廣泛研究,是人乳中僅次于乳糖和脂肪的第三大固形物含量物質[1],成熟乳中人乳寡糖含量約為10～15 g/L,人初乳中人乳寡糖含量約為20～24 g/L[2]。目前2′-巖藻糖基乳糖以及乳酰-N-新四糖(lacto-N-neotetraose,LNnT)等多種人乳寡糖作為營養強化劑被應用于商業化生產的嬰幼兒配方奶粉中[3]。

LNnT是人乳寡糖中含量相對較高的成分之一[4],屬于非巖藻糖基化的中性母乳寡糖,具有免疫調節[5]、腸細胞反應調節劑[6]和促進細胞成熟[7-9]等生理功能。

目前,LNnT的生產主要包括化學合成[10-11]、酶法合成和微生物發酵法[12]3種方法,酶法合成往往需要添加昂貴的前體物質,但生物合成法可利用廉價可再生底物,具有清潔、綠色、高效等特征,因此具有更為廣闊的應用前景[13]。

通過綠色生物過程利用廉價生物質生產高附加值產品是實現碳中和及環境友好經濟的重要途徑。隨著代謝工程和合成生物學的發展,綠色、高效、安全型底盤微生物的開發成為解決HMOs規模化生產和應用的關鍵。當前,乳酰-N-新四糖生產菌株常見于大腸桿菌[14],報道較少且產量偏低。

本研究旨在利用合成生物學手段,在通過CRISPR-Cas9系統[15]敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ[16]和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向異構酶基因wecB消除競爭抑制途徑,減少底物乳糖和相關前體尿苷二磷酸-N-乙酰基葡萄糖胺的損失,弱化分支途徑,使更多的碳流向乳酰-N-新四糖合成通路,有利于乳酰-N-新四糖的高效生物合成的基礎之上,通過模塊化LNnT通路關鍵基因的構建與組合[17],過表達關鍵基因尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向異構酶基因galE、谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基轉移酶基因glmS、β-1,4-半乳糖基轉移酶基因NmlgtB以及β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉移酶基因lgtA,上調從頭合成途徑的關鍵酶等策略實現產乳酰-N-新四糖的工程菌的構建和乳酰-N-新四糖的高效合成(如圖1所示)。

圖1 LNnT從頭合成途徑圖Fig.1 Route diagram of LNnT de novo synthesis

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

實驗所需基因lgtA和NmlgtB來源于大腸桿菌K12,glmS和galE來源于腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriaceaemeningitidis),宿主BL21(DE3)ΔlacZΔwecB為本實驗室保存菌株。

DNA產物、質粒的測序工作交予金唯智生物技術(蘇州)有限公司完成。pCOLADuet-1、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1,購自上海百風生物科技有限公司;載體pCas9、pTargetF,Addgene。

1.1.2 主要試劑及儀器

PrimeSTAR Max DNA Polymerase、QuickCut Enzyme,TaKaRa(大連)生物有限公司;一步克隆酶,南京諾唯贊生物科技有限公司;酵母提取物、Rapid Bacterial Genomic DNA Isolation Kit、Ultra-Competent Cell Preps Kit、瓊脂粉、胰蛋白胨,生工生物工程(上海)股份有限公司;標準品LNnT,Carbosynth (Berkshire, UK);葡萄糖、檸檬酸及其他常用試劑均為國產分析純。

Waters e2695高效液相色譜,美國Waters公司;高速落地離心機、電轉儀,德國Eppendorf有限公司。

1.1.3 培養基

LB(Luria-Bertani)培養基(g/L):酵母提取物5,胰蛋白胨10,NaCl 10(固體培養基額外添加瓊脂粉15～20 g/L)。

DM發酵培養基:甘油20 g/L,KH2PO413.5 g/L,酵母提取物10 g/L,檸檬酸1.7 g/L,(NH4)2HPO44.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.4 g/L,微量金屬溶液10 mL/L(檸檬酸三鐵10 g/L,MgSO4·7H2O 2.25 g/L,CuSO4·5H2O 1.0 g/L, MnSO4·H2O 0.35 g/L,硼砂0.23 g/L,鉬酸銨0.11 g/L,CaCl2.2H2O 2.0 g/L),pH 6.8。

根據菌株抗性在培養基中添加相應抗生素,后文無特殊說明均為以下質量濃度:氨芐青霉素(100 mg/L)、硫酸鏈霉素(50 mg/L)、鏈霉素(50 mg/L)、氯霉素(50 mg/L)、壯觀霉素(50 mg/L)。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質粒構建

游離表達lgtA、glmS、galE、NmlgtB。利用引物galE-F/galER和glmS-F/glmS-R(引物序列見表1,下同),獲得galE和glmS基因片段,通過一步克隆酶連接到載體pACYDuet-1的相應酶切位點之間(BamH I/SaiI和BgiII/xho,下同),最終獲得質粒pACY-glmS-galE。質粒pET-lgtA-NmlgtB構建方法同上。

將上述構建的重組質粒均轉入大腸桿菌BL21(DE3)ΔlacZΔwecB,搖瓶發酵并定時取樣,利用HPLC定量測定LNnT含量。

1.2.2 組合優化

以質粒pACY-glmS-galE為模板,利用引物glmS-galE-F/glmS-galE-R(引物序列見表2,下同)擴增出glmS-galE基因片段,構建方法參照1.2.1節,獲得質粒pET-glmS-galE、pCDF-glmS-galE和pRSF-glmS-gal(相應酶切位點為BgiII/xhoI)。

以質粒pET-lgtA-NmlgtB為模板,利用引物lgtA-NmlgtB-F/lgtA-NmlgtB-R(引物序列見表2)擴增出lgtA-NmlgtB基因片段,構建方法同上,獲得質粒pAC-lgtA-NmlgtB、pCDF-lgtA-NmlgtB和pRSF-lgtA-NmlgtB(相應酶切位點為BgiII/xhoI)。

將上述獲得的質粒表達glmS-galE基因片段的質粒(pCDF-glmS-galE、pACY-glmS-galE、pRSF-glmS-galE、pET-glmS-galE)和表達lgtA-NmlgtB基因片段的質粒(pAC-lgtA-NmlgtB、pCDF-lgtA-NmlgtB、pRSF-lgtA-NmlgtB、pET-glmS-galE)進行組合,并轉入構建的EL0大腸桿菌BL21(DE3)ΔlacZΔwecB,得到了12個不同的菌株,分別表示為SA1～SA12(表2)。搖瓶發酵并定時取樣,利用HPLC定量測定LNnT含量。

1.2.3 搖瓶優化

1.2.3.1 培養基種類對LNnT產量的影響[18-20]

M9培養基(原始對照組):20 g/L甘油,12.8 g/L NaHPO4·7H2O,3 g/L KH2PO4,2 g/L NH4Cl,0.5 g/L NaCl,0.25 g/L MgSO4·7H2O,14.7 g/L CaCl2·2H2O,10 g/L Triton X-100(0.1%,體積分數),1 mL/L·微量金屬溶液(25 g/L FeCl3·6H2O,2 g/L CaCl2·2H2O,2 g/L ZnCl2,2 g/L Na2MoO4·2H2O,1.9 g/L CuSO4·5H2O,0.5 g/L Н3BO3),pH 6.8。

M9CA培養基:20 g/L 甘油,13.3 g/L M9CA鹽(上海生工生物工程股份有限公司,具體組分為:2.0 g/L Casamino Acid;6.8 g/L Na2HPO4;3.0 g/L KH2PO4;1.0 g/L NH4Cl;0.5 g/L NaCl),1.4 g/L MgSO4,10 mg/L鹽酸硫胺素。

MOPS培養基:10×MOPS母液(/L):1 mol/L MOPS溶液400 mL,pH 7.4;1 mol/L Tricine 40 mL,pH 7.4;0.01 mol/L FeSO410 mL;1.90 mol/L NH4Cl 50 mL;0.276 mol/L K2SO410 mL;5.0×10-4mol/L CaCl2l0 mL;0.528 mol/L MgCl210 mL;5.0 mol/L NaCl 100 mL;微量元素:3×10-6mol/L (NH4)6(MO)24,4×10-4mol/L H3BO2,3×10-5mol/L CoCl2,10-5mol/L CuSO4,8×10-5mol/L MnCl2,10-5mol/L ZnSO410 mL,無菌蒸餾水360 mL。

MOPS培養基:10×MOPS母液100 mL,0.132 mol K2HPO410 mL,NH4Cl 4 g,甘油20 g,去離子水890 mL。

分別選用M9培養基、M9CA培養基、MOPS培養基和DM培養基作為發酵培養基,通過搖瓶發酵探究不同發酵培養基對LNnT產量的影響。

1.2.3.2 誘導溫度對LNnT產量的影響

選用不同的誘導溫度(20、25、28、30、37 ℃),通過搖瓶發酵探究不同誘導溫度下LNnT的產量變化情況。

1.2.3.3 誘導濃度對LNnT產量的影響

選用不同的誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)添加量(0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L),使用DM培養基進行發酵培養,通過搖瓶發酵探究不同誘導劑IPTG添加量對LNnT產量的影響。

1.2.3.4 誘導時間對LNnT產量的影響

選用不同的誘導時間(2、4、6、7、8、9 h),通過搖瓶發酵探究不同誘導時間對LNnT產量的影響。

1.2.4 發酵培養及誘導表達

挑取LB平板上劃線分離的單菌落接種于液體LB培養基中,37 ℃,200 r/min,過夜培養;種子液接種量為2%(體積分數),加入相應抗生素,37 ℃,200 r/min,OD600=0.6時誘導,IPTG濃度為0.4 mmol/L,將溫度改為25 ℃,誘導48 h后取樣。

1.2.5 分批補料發酵

發酵條件:種子液接種量為5%,初始乳糖質量濃度為10 g/L,發酵罐培養基初始甘油質量濃度為20 g/L,通氣量2 vvm,轉速800 r/min,培養溫度37 ℃,發酵過程利用體積分數14%的NH4OH調節發酵罐pH為6.80。發酵過程中控制甘油濃度在較低水平以提高產物積累量,控制底物乳糖質量濃度在(10±0.5) g/L左右,發酵罐溶氧為(30±5)%。

1.2.6 檢測方法

通過HPLC測定乳酰-N-新四糖的生成量。1 mL發酵液煮沸5 min,12 000 r/min高速離心5 min,通過0.22 μm 的膜過濾處理。

使用HPLC測定LNnT生成量所用檢測器為示差折光檢測器,色譜柱為Rezex ROA-organic acid (Phenomenex,USA),柱溫50 ℃;流動相0.005 mol/L的H2SO4水溶液,流速0.6 mL/min;進樣量10 μL。

1.2.7 數據處理

使用Origin 8.5軟件繪制本文圖像,使用SPSS 20.0軟件對實驗數據進行統計學處理。

2 結果與分析

2.1 模塊組合優化

為了優化LNnT的合成途徑,引入模塊組合優化,通過不同拷貝數的質粒改變模塊的代謝通量,將LNnT合成途徑分為模塊I(基因glmS和galE)與模塊Ⅱ(lgtA和NmlgtB)。將攜帶基因glmS-galE和lgtA-NmlgtB的不同載體組合導入宿主BL21(DE3)ΔlacZΔwecB中,獲得如表2所示的菌株SA1～SA12。對12個不同的菌株搖瓶發酵后的乳酰-N-新四糖的產量分別為1.168、0.423、0.693、0.187、0.645、0.452、0.365、0.420、0.463、0.105、0.243、0.105 g/L。其中含有重組質粒pET-glmS-galE和pRSF-lgtA-NmlgtB的工程菌SA1獲得了1.168 g/L的最高產量(見圖2)。

模塊的表達量值由質粒拷貝數決定,質粒pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1的質粒拷貝數分別約為>100,～40,20～40,10～20[21]。

搖瓶培養后,全部菌株均具有產LNnT的能力,但產量差異較大。大多數菌株產生的LNnT低于0.5 g/L,但SA1、SA3和SA5在內的3個菌株分別產生了1.168、0.693、0.645 g/L的LNnT,所得菌株SA1含有pET-glmS-galE和pRSF-lgtA-NmlgtB,作為LNnT生物合成的最佳菌株,產量為1.168 g/L。因此,lgtA、NmlgtB、glmS和galE基因相對高水平的表達有助于LNnT在細胞中的高效代謝合成。

結果表明,結合的高拷貝數質粒,菌株SA1顯示出各種模塊表達對提高LNnT產量的協同效應(1.168 g/L),可能是因為過表達關鍵酶基因減輕了中間產物的積累,并促進了中間產物向目標產物的有效轉化。

工程菌SA6與SA1相比,菌體生物量(OD600)從9.60上升到了12.56,增加了30.8%,這可能是由于產物合成途徑的碳通量部分流向了細胞生長的方向。

2.2 搖瓶發酵優化結果

2.2.1 培養基種類對LNnT產量的影響

對于LNnT的搖瓶發酵生產來說,培養條件是較為重要的外部條件,因此對發酵條件進行優化是有必要的。選取M9培養基(原始對照組)、M9CA培養基、MOPS培養基和DM培養基4種培養基作為發酵培養基,研究選擇最優菌株SA1的最適培養基組成。

結果如圖3所示,DM培養基中LNnT產量更高,OD600相較于其他培養基更高,表明菌體生長可能更有助于LNnT的積累,可能是M9(原始對照組)、M9CA以及MOPS培養基中含有無機氮源NH4Cl,且濃度相對較高,有文獻表示NH4Cl濃度過高可能會抑制細胞的生長從而降低產物積累[22],與本文實驗結果一致。因此選用DM培養基作為工程菌株發酵培養基。

圖3 不同培養基種類對LNnT生產的影響Fig.3 Effects of different kinds of culture media on LNnT production

2.2.2 誘導溫度對LNnT產量的影響

由圖4可知,隨著誘導溫度的增加,LNnT的產量也隨之增加,表示在一定溫度范圍內,LNnT的產量隨著溫度的升高而增加,但當誘導溫度>25 ℃時,隨著溫度的升高,工程菌株產LNnT的能力隨著溫度的升高反而降低,最佳誘導溫度為25 ℃。酶促反應及細胞生長與溫度變化有關,隨著溫度的上升,反應速度加快,呼吸強度增加,細胞生長繁殖加快。但隨著溫度的持續上升,酶的正確折疊受到影響,不利于LNnT的發酵生產[22]。

圖4 不同誘導溫度對LNnT生產的影響Fig.4 Effect of different induction temperatures on LNnT production

2.2.3 誘導濃度對LNnT產量的影響

由圖5可知,LNnT產物積累隨著誘導劑IPTG的濃度出現先增加后降低的趨勢,最佳誘導濃度為0.2 mmol/L。有研究表明lgtA基因在異源表達時易形成包涵體[23],可能中等濃度的誘導劑有利于關鍵基因的可溶性過表達,從而促進LNnT的生產。

圖5 不同誘導濃度對LNnT生產的影響Fig.5 Effects of different inducing concentrations on LNnT production

2.2.4 誘導時間對LNnT產量的影響

由圖6可知,隨著誘導時間的增加,LNnT產量隨著誘導時間的增加而增加,當誘導時間為8 h時,LNnT產量達到最大值(2.50 g/L),之后產量降低。可能是因為當誘導時間過短時,細胞菌體量及酶的表達量較少,導致產物積累量減少,而當誘導時間超過8 h時,細胞菌體量過多,大量碳源被生長代謝消耗,從而減少LNnT產物的積累,故最佳誘導時間為8 h。

圖6 不同誘導時間對LNnT生產的影響Fig.6 Effect of different induction time on LNnT production

2.3 補料分批發酵

由表3可知,DONG等[24]在枯草芽孢桿菌168中過表達lacY、lgtA和lgtB,通過引入模塊化工程策略,平衡關鍵前體物質,在搖瓶發酵條件下,LNnT產量為1.95 g/L,補料分批發酵產量為4.52 g/L。此外,通過下調競爭途徑關鍵基因的表達水平可以提高LNnT的產量,在搖瓶發酵條件下,LNnT產量為2.3 g/L,通過補料分批發酵,LNnT產量提高到5.41 g/L[25]。

表3 國內外產LNnT方法及產量相關報道詳細信息Table 3 Reports on LNnT production methods and output at home and abroad

ZHANG等[26]通過在大腸桿菌K12中過表達lgtA、lgtB構建從頭合成途徑,通過過表達lacY提高LNnT產量,在搖瓶發酵條件下,LNnT產量為1.2 g/L。

ZHANG等[14]通過在大腸桿菌中過表達lgtA、galE、galT,并利用不同拷貝數質粒進行組合優化,對培養基條件進行優化后,在搖瓶發酵條件下,LNnT產量為1.25 g/L,補料分批發酵產量為12.1 g/L。

分批補料發酵過程如圖7所示,培養11 h后菌體OD600達到20時進行誘導,加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L,誘導溫度為30 ℃,初始乳糖的質量濃度為10 g/L。為了維持菌體生長以及LNnT的合成,待初始甘油消耗完后流加800 g/L的甘油(含20 g/L的MgSO4·7H2O,0.2 g/L硫胺素)以補充碳源,通過pH反饋調節(設置流速為20 mL/h)使甘油在發酵體系中的濃度維持在較低濃度水平(甘油用于菌體生長和代謝,質量濃度約為0 g/L)至發酵結束。

圖7 工程菌SA1補料分批發酵生物合成LNnTFig.7 Biosynthesis of LNnT by fed-batch fermentation of engineering strain SA1

待初始乳糖消耗完后手動補加300 g/L的乳糖并使其在發酵體系中的終質量濃度維持在(10±0.5) g/L左右,發酵過程中若乳糖消耗至<5 g/L時繼續補加乳糖至發酵結束。18 h后逐漸產生LNnT。發酵65 h后LNnT收率達到最大值(14.25 g/L)是搖瓶發酵的5.7倍。

本研究通過在E.coliBL21(DE3)ΔlacZΔwecB中過表達lgtA、lgtB、galE、glmS,構建LNnT從頭合成途徑,通過調控代謝通路關鍵酶基因的拷貝數以及優化搖瓶發酵條件,以提高LNnT產量,在搖瓶發酵條件下,LNnT產量為2.5 g/L,通過補料分批發酵,LNnT產量提高到14.25 g/L(如圖7所示),優于目前文獻報道的產量(如表3所示)。

3 結論

本文以大腸桿菌BL21(DE3)ΔlacZΔwecB為出發菌株,通過調控中心碳代謝并弱化副產物途徑、重構乳酰-N-新四糖合成途徑、上調從頭合成途徑的關鍵酶、調控代謝通路基因的拷貝數以及搖瓶發酵條件優化等策略實現工程菌的構建和乳酰-N-新四糖的高效合成。本文得到的重組大腸桿菌可以利用乳糖高效合成乳酰-N-新四糖,搖瓶發酵產乳酰-N-新四糖胞外產量達2.50 g/L,補料分批發酵產量為14.25 g/L,是目前報道的最高LNnT產量。本研究為利用微生物工業化生產LNnT提供方法學研究思路,然而,發酵過程仍需添加抗生素,可能導致生產成本的增加以及生物安全問題,后續可考慮將關鍵酶基因整合至染色體,降低生產成本。