地衣芽胞桿菌來源的漆酶BlLac的活性和熱穩定性改造

黃愛敏,郭忠鵬,李默影,郭自濤,顧正華,張梁,辛瑜

(江南大學 糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)

漆酶是一種氧化還原酶,來源廣泛,包括植物、昆蟲、真菌和細菌等。在分子氧的存在下,漆酶可以通過單電子催化氧化底物,同時將氧分子還原為水[1-2]。作為催化劑,漆酶具有底物廣泛、無二次污染、效率高等優點[3-4],這樣優良的催化性能使其被廣泛應用于紙漿漂白、環境處理、生物檢測、食品加工、有機合成和生物能源等領域[5-6]。

然而,天然漆酶的穩定性低、活性差、易受環境因素影響、重復使用困難等缺點限制了其實際應用[7-8]。為了改善這些現狀,研究者們采用了多種改性方法,如蛋白質工程、固定化和培養基工程。而蛋白質工程已被證明是開發具有改進特性或警示功能的生物催化劑的有效策略。其中理性設計是一種可靠的技術,通常用于識別基于先驗結構信息的突變熱點殘基。CHEN等[9]在計算機輔助設計程序的支持下,采用了定點突變方法來提高短小芽孢桿菌CotA漆酶對ABTS的特異性,以及其熱穩定性。SANTIAGO等[10]成功地將計算方法與實驗驗證相結合,合理設計了一種用于聚苯胺生產的改進漆酶。經過進化后,改良型的kcat值提高了2倍。WANG等[11]采用基于親和力的虛擬突變分析出了枯草芽胞桿菌漆酶降解HPAM-3的關鍵氨基酸殘基。GARCIA等[12]通過在來自色鏈霉菌的小漆酶蛋白(SLac)中引入新的二硫鍵,使該酶對不可逆熱變性表現出了更強的抵抗力。

本實驗對來自地衣芽胞桿菌的漆酶BlLac進行了研究,為了提高它的工業適用性,我們對該酶進行了理性設計改造,在同源建模和與底物ABTS對接后,采用虛擬氨基酸突變的方法,利用軟件Discovery Studio 4.0計算突變結合能變化以及預設二硫鍵,通過突變文庫的篩選最后構建出優化的突變體,并對其分子結構進行了分析,闡明了酶活性提高和熱穩定性提升的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

地衣芽胞桿菌來源的漆酶基因BlLac(GenBank:AAU23292.2)的氨基酸序列來自國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI),由生工生物工程(上海)股份有限公司進行全基因合成。大腸桿菌EscherichiacoliJM109和枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)WB600分別被用于重組質粒擴增和蛋白表達,質粒pMA5被用作表達載體(啟動子已經過優化)[13],均由本實驗室保藏。

1.1.2 試劑與儀器

ABTS、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素(kana)、溶菌酶、木糖,生工生物工程(上海)股份有限公司;Mut Express ⅡFast Mutagenesis Kit V2 突變試劑盒、One-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit(12%)、BCA蛋白質定量試劑盒、180 kDa蛋白預染marker,諾唯贊生物科技有限公司;引物,金唯智生物科技有限公司。

PCR擴增儀,伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;超凈工作臺,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;高速冷凍離心機,日立(中國)有限公司;酶標儀,帝肯(上海)貿易有限公司;恒溫金屬浴,杭州博日科技股份有限公司;凝膠成像系統,伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;蛋白純化系統,蘇州賽普儀器有限公司;Nano-dsc,美國TA公司;Biologic ALX 250分光光度計,賽默飛世爾科技公司。

1.1.3 培養基與緩沖液

LB(Luria-Bertani)液體培養基(g/L):胰蛋白胨10.0,NaCl 10.0,酵母粉5.0,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

TB(terrific broth)液體培養基(g/L):蛋白胨12.0、酵母提取物24.0、甘油4 mL、KH2PO42.31、K2HPO416.2,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

Tris-HCl緩沖液:2.422 8 g/L Tris,用HCl溶液調pH至8.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 同源建模與分子對接

通過同源結構構建網站SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/assess),以序列一致性與BlLac達到99.64%的地衣芽胞桿菌假定蛋白(PDB ID:6DZD)為模板,構建3D模型。以ABTS為配體,使用軟件Discovery Studio 2019 CDOKER模塊進行蛋白質-配體柔性對接[14]。該配體的三維結構從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)網站下載。

1.2.2 突變文庫的構建

本研究利用Discovery Studio軟件對分子對接結果進行可視化分析,通過氫鍵、Pi鍵、鹽橋離子鍵等相互作用力來定義重要氨基酸,使用Mutation Energy模塊對這些氨基酸位點進行虛擬的定點飽和突變,根據突變能量(Mutation Energy)變化從低到高對氨基酸突變的結果進行排序,選擇突變能量較低的突變體,進行合理的氨基酸突變,從而提高酶的活力。同時,通過Discovery Studio軟件Predict Disulfide Bridges模塊對該蛋白結構模型進行二硫鍵的預設,根據預測的每對二硫鍵對穩定性的影響,同時考慮到以下參數條件:能量變化<5.0、過近接觸為0、溫度因子變化>20.0、氨基酸埋藏深度3～8等[15],尋找到相應的突變位點,以提高該酶的熱穩定性。

1.2.3 突變體的構建,表達和純化

通過(vazyme.com)在線服務設計引物,由金唯智生物科技有限公司合成后進行單點突變,并且以單點突變為基礎進行組合突變,具體的突變過程使用Mut Express Ⅱ Fast Mutagenesis Kit V2 突變試劑盒進行。將重組產物轉化至大腸桿菌EscherichiacoliJM109感受態中,提取質粒并進行DNA測序,然后將測序成功的質粒轉化到B.subtilisWB600感受態細胞中,對單菌落進行菌落PCR驗證,引物如電子增強出版附件1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034552)所示。挑取驗證成功的單菌落接種至10 mL LB(kana)(50 μg/mL)培養基中,在37 ℃、200 r/min振蕩培養12 h,后以5%的接種量轉接至150 mL TB(kana)(50 μg/mL)培養基中,以37 ℃、200 r/min過夜培養10 h左右(待OD600達到2.0),然后加入終質量濃度為20 mg/mL的木糖在37 ℃、200 r/min誘導培養2 h,收集的菌體可先儲存-20 ℃備用。將收到的菌體與20 mmol/L(pH=8)的Tris-HCl 緩沖液以1∶20(g∶mL)的比例重懸,并向重懸液里加入0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L咪唑和質量分數1%的20 mg/mL溶菌酶,在37 ℃的培養箱中靜置3 h,然后使用超聲細胞破碎儀在冰上破碎細胞,所得破碎液在低溫條件下進行高速離心。上清液用于蛋白純化,利用鎳柱親和層析柱進行純化,將200 mmol/L洗脫下來的蛋白經過超濾濃縮,從而得到目的蛋白酶液。采用SDS-PAGE分析蛋白條帶。

1.2.4 蛋白濃度的測定

以牛血清白蛋白為參照物,采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.5 酶活性的檢測

通過ABTS氧化法測定該酶的活性。將180 μL,pH 4.5的0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液和終濃度為40 μmol/L的ABTS溶液在37 ℃下孵育5 min,該反應直接在酶標板中進行,加入100 μL 的待測樣品后,立即在420 nm處測量吸光度的增加。一個酶活力單位被定義為在37 ℃下1 min能轉化1 μmol/L底物的酶量,計算方法如公式(1)和公式(2)所示:

(1)

式中:A,420 nm處吸光度值的變化;Vt,反應體系的體積,mL;Vs,酶液樣品體積,mL;ε,ABTS陽離子自由基的摩爾消光系數,ε=36(μmol/mL)-1·cm-1;L,光徑,cm;t,反應時間,min。

(2)

1.2.6 動力學參數的測定

以不同濃度的ABTS來測定酶的動力學參數,反應體系中ABTS的系列濃度為0.02～0.5 mmoL/L,將反應體系中ABTS溶液(20 μL)和0.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液(180 μL, pH 4.5)置于37 ℃的條件下預熱,然后加入100 μL 的純酶液測定5 min內OD420值的變化。根據公式(1)計算酶活力。動力學參數由米氏方程擬合。

1.2.7 半衰期的測定

將稀釋好的酶液放置在40 ℃的水浴鍋中保溫,每隔30 min取一次樣進行酶活力測定,以初始相對酶活力為100%,根據指數衰減定律計算酶活力下降到50%所需要的時間。

1.2.8 溫度和pH對BlLac的影響

為了確定溫度和pH對該酶的影響,以ABTS為底物在不同溫度(20～80 ℃)和不同pH(3～6.5)下測定酶活性,從而確定最適溫度和最適pH。通過酶溶液在不同溫度(30、40、50 ℃)下孵育一段時間后的殘余活性,確定該酶的熱穩定性。通過測量酶在不同pH(3～10.6)、4 ℃下孵育2 h后的殘余活性,確定該酶在酸堿條件下的穩定性。各種pH緩沖溶液分別為:Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH 3.0～8.0)、甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 8.6～10.6)。

1.2.9 納米差示掃描量熱(nano differential scanning calorimetry,Nano DSC)分析

采用納米差示掃描量熱法測定該酶的Tm值。每個分析樣品的蛋白質質量濃度控制在1 mg/mL左右,在注入儀器之前,樣品將脫氣10 min。在操作過程中,樣品以1 ℃/min的速率從35 ℃加熱到95 ℃。通過數據分析軟件Nano Analyze得到最終結果。

1.2.10 圓二色光譜(circular dichroism,CD)研究

在20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)中,用分光光度計在室溫下測定純化漆酶的紫外-CD光譜[16]。在平臺國家重點實驗室采用紫外(190～250 nm)CD光譜法測定酶的二級結構[17],利用DichroWeb的SELCON3分析程序(http://dichroweb.cryst bbk.ac.uk/html/process.shtml)計算二級結構元素[18]。

2 結果與分析

2.1 突變體的構建和篩選

2.1.1 突變文庫一:基于相互作用力的氨基酸突變以提高酶活力

利用軟件Discovery Studio將ABTS對接至蛋白質3D結構模型(PDB ID:6DZD)中(圖1),獲得酶-底物復合體結構。定義距底物5 ?范圍內的氨基酸殘基組成催化口袋,包含11個位點:CYS A:189、ARG B:222、ILE B:216、LYS A:226、LYS B:217、GLU A:224、VAL A:245、GLU A:244、ASN A:240、GLU B:218、ARG A:230。將這11 種氨基酸分別進行單點突變,使用Discovery Studio的工具欄Macromolecules的Calculate Mutation Energy(Binding)模塊計算催化口袋220個單點突變的突變能量,將計算結果按照突變能量由低到高排序,選擇突變能量較低,實現在理論上能夠穩定活性位點與酶相互作用的突變,如電子增強出版附件2所示,共包含了35個單點突變。

圖1 底物ABTS與蛋白對接結果Fig.1 Result of substrate ABTS docking with protein

將這35個單點突變體構建并在枯草芽胞桿菌中誘導表達后,選擇有效突變體測定其酶活力和動力學參數,結果如圖2、電子增強出版附件3和附件4所示,發現其比酶活力與催化效率(kcat/Km)的變化基本一致。突變體C189A、K217F、V245Y、S247F、K226S、E227Y的催化效率(kcat/Km)分別達到野生型的10.9、5.9、4.3、1.3、22、3.1倍,分析研究數據可知,這幾個突變體由于生成底物的速率都有明顯的提升,因此催化效率都有所提高,而部分優秀突變體,如K226S在kcat值明顯提高的同時,Km值顯著下降,對底物的親和能力也大大提升,所以其對底物的催化效率也相應提高。為了達到更好的改造效果,本文將催化效率最高的突變體K226S與其他5個突變體進行了組合突變,根據比酶活力(電子增強出版附件3)和動力學參數(圖2和電子增強出版附件4)結果顯示,組合突變均未達到K226S單點突變的改造效果,而組合雙突變體中,除了K226S/S247F之外,Km值均低于野生型。而本突變文庫針對結合能最低化的設計就是為了增強底物與酶之間的親和力,因此該組合突變基本達到了突變目的。但是組合突變可能減緩了反應結束后產物的釋放,從而導致kcat值下降,因此整體催化效率提升沒有單突變那么顯著。

a-Kcat值的熱圖分析;b-Km值的熱圖分析;c-kcat/Km值的熱圖分析圖2 野生型和突變文庫Ⅰ的突變體的動力學參數的熱圖分析Fig.2 Thermal analysis of kinetic parameters of the mutant library I and WT

同時,對該突變文庫的單點突變體和雙點突變體在40 ℃下測定了其半衰期,結果如圖3所示,發現大部分突變體熱穩定性有所下降或趨于同等水平,其中V245R、V245Y的熱穩定性分別是野生型的1.8倍和1.4倍,為了得到熱穩定性更高的突變體,本文構建了另一個突變文庫進行后續實驗。

圖3 野生型和突變文庫Ⅰ的突變體在40 ℃下的半衰期Fig.3 Half-life of the mutant library I and WT at 40 ℃

由于突變文庫一中的突變體K226S、C189A和K217F對底物的催化效率有較為明顯的提升,本文將選取這3種突變體進行后續實驗。

2.1.2 突變文庫二:預測突變形成二硫鍵以增強穩定性

據報道,通過氨基酸突變形成二硫鍵,從而可以增強蛋白質的穩定性[19]。本文使用軟件Discovery Studio對蛋白質3D結構模型(PDB ID:6DZD)預設21對二硫鍵,根據模擬結果和各項打分以及Pymol觀察模擬后,最終確定了4對較為合理的二硫鍵預測,其結果和模擬結構如電子增強出版附件5所示。

采用定點突變構建共計4個突變體:S251C、G151C、G187C、V1(A156C/K200C)。將野生型與這4個突變體表達純化后,測定其比酶活力和動力學參數,結果如電子增強出版附件6和表1所示。研究結果表明,突變體的酶催化效率與野生型相比,大部分有所降低或者處于同樣的水平,分析原因可能是二硫鍵的引入導致酶的柔性部分受阻,從而不能正常發揮催化活性。測定其在40 ℃下的半衰期,結果如圖4所示,在熱穩定性上,這4種突變體均具有較為明顯的改造效果,S251C、G151C、G187C、V1在40 ℃下的半衰期分別是野生型的3.2、3.2、2.4、2倍,說明二硫鍵的引入對該酶的穩定性有較好的提升效果。接著將這4種突變體兩兩組合進行組合突變,以期得到更好的改造效果,共計6個突變體:S251C-V1、S251C-G151C、S251C-G187C、V1-G151C、V1-G187C、G151C-G187C。由電子增強出版附件6和表1可知,可能是由于原本突變體的酶活性不高,該組合突變對酶活性的改造亦沒有明顯效果。在40 ℃下的半衰期(圖4)結果表明,組合突變體的熱穩定性并沒有原本突變體好,這可能是由于多對二硫鍵的引入會對蛋白質的整體結構造成影響,從而不利于結構的穩定性。因此,本文選取突變文庫二中熱穩定性較好的突變體S251C和V1進行后續實驗。

表1 野生型和突變文庫二的突變體的動力學參數Table 1 Kinetic parameters of the mutant library Ⅱ and WT

圖4 野生型和突變文庫二的突變體在40 ℃的半衰期。Fig.4 Half-life of the mutant library II and WT at 40 ℃

2.1.3 突變文庫一與突變文庫二的組合突變

基于2.1.1節和2.1.2節分別篩選出來的優質突變體,為了使該酶的活力和熱穩定性同時提升,本研究選取突變文庫一中的3種優異突變體K226S、C189A、K217F與突變文庫二中的2種優異突變體S251C和V1進行組合突變,獲得6種組合突變體:K226S-S251C、K226S-V1、C189A-S251C、C189A-V1、K217F-S251C、K217F-V1。同樣,對組合突變體的比酶活力、動力學參數和在40 ℃下的半衰期進行測定,研究結果(電子增強出版附件7、表2和圖5)顯示,相對于野生型,組合突變體C189A-S251C在底物催化效率提高了5.3倍的同時,在40 ℃下的熱穩定性也提高了1.2倍,展現出了較好的底物催化效率和比較高的熱穩定性,因此,本文篩選出最優突變體C189A-S251C進行后續的實驗。

表2 組合突變體的動力學參數Table 2 Kinetic parameters of combined mutants

圖5 組合突變體在40 ℃下的半衰期Fig.5 Half-life of the combined mutants at 40 ℃

2.2 溫度和pH對野生型和突變體的影響

2.2.1 野生型和突變體的最適溫度和最適pH

首先,在20～80 ℃下測定野生型和突變體C189A-S251C的酶活力,如圖6-a所示,在30～55 ℃,兩者都檢測到比較高的活性,而突變體C189A-S251C的最適溫度為50 ℃,比野生型的最適溫度37 ℃要高,且該突變體在80 ℃下仍能檢測到55%左右的活性,分析由于該突變體內含的二硫鍵使其穩定性提高,使最適溫度也相應提升。

a-最適溫度;b-最適pH圖6 野生型和突變體C189A-S251C的最適溫度和最適pHFig.6 Optimal temperature and pH for wild-type and its mutant C189A-S251C

然后,采用不同的pH緩沖液測定該酶在37 ℃下的最適pH。如圖6-b所示,含有100 mmol/L檸檬酸的緩沖液pH為4.0～4.5,檢測到較高的活性,并且野生型和突變體的酶活力均在pH值為4.5時最高。此結果表明,最適反應pH不受該突變的影響。

2.2.2 野生型和突變體的pH穩定性和溫度穩定性

pH穩定性的結果表明,該酶在改造之后,在酸性溶液中的穩定性增強了(圖7-a)。野生型在pH 6.5時穩定,而突變體C189A-S251C在pH 5.5時穩定。并且與野生型相比,突變體在pH 3.0下孵育2 h后保持了約52%的殘余酶活力。

a-pH穩定性;b-30 ℃下溫度穩定性;c-40 ℃下溫度穩定性;d-50 ℃下溫度穩定性圖7 野生型和突變體C189A-S251C的pH穩定性和溫度穩定性Fig.7 pH and temperature stability of wild-type and its mutant C189A-S251C

根據熱穩定性研究(圖7-b～圖7-d),突變體C189A-S251C的溫度穩定性要優于野生型,尤其在50 ℃下的野生型孵育40 min后,其剩余酶活力幾乎為0,而突變體C189A-S251C的剩余酶活力在50%左右。

2.3 Nano DSC分析

如表3所示,原始酶的Tm值為54.23 ℃,而突變體C189A-S251C的Tm值為57.39 ℃,上升了約3 ℃,說明該突變體的熱穩定性高于野生型。而焓變(ΔH)則反映了蛋白質分子的聚集程度和疏水性/親水性,該突變體的焓變值要低于野生型,說明經過突變,該蛋白結構內部的疏水作用力減弱,使得分子的聚集程度降低。該結果與上述研究結果相對應,且為該突變體熱穩定性的提高提供了理論依據。

表3 野生型和突變體C189A-S251C的Tm值Table 3 Tm values of wild-type and its mutant C189A-S251C

2.4 二級結構變化研究

利用CD技術分析了由突變引起的蛋白質二級結構的變化,該酶的二級結構中富含α-螺旋,β-折疊比較缺乏。突變體C189A-S251C導致了α-螺旋的下降和β-折疊的上升,β-轉角和無規則卷曲的含量基本不變,分別保持在20%和30%左右的水平。本文推斷,該二級結構的變化也是引起突變體酶活力上升和熱穩定性提高的原因之一。結果如表4和圖8所示。

表4 野生型和突變體的二級結構Table 4 Secondary structures of wild-type and mutants

圖8 WT和突變體C189A-S251C的CD光譜Fig.8 CD spectra of WT and its mutant C189A-S215C

2.5 突變體的模擬結構分析

為了進一步探究突變體C189A-S251C催化活性和熱穩定性提高的原因,本研究利用軟件Pymol對野生型和突變體與底物ABTS對接后的三維結構進行分析。氫鍵在配體識別和結合中起著至關重要的作用[20],并且氫鍵網絡的合理改變可能引起酶的構象變化,從而提高酶的活性或穩定性[21]。如圖9所示,該突變改變了突變位點附近的氫鍵與配體的相互作用。一方面,與野生型相比,突變體C189A-S251C與底物ABTS形成的氫鍵相互作用減少,ARG B:222與底物ABTS相互作用的鍵長由1.76 ?變為2.04 ?,這些改變將增加酶的靈活性,使催化中心更容易接近底物[22]。另一方面,突變酶與底物之間形成了新的氫鍵,如CYS B:190與底物ABTS之間的氫鍵,距離為3.04 ?,這種必需殘基與配體之間相對較短的距離可以提高酶的催化效率[23],使催化通道底部的位點和配體結合位點之間的相互作用更加積極,此外,新形成端的氫鍵可能有助于穩定酶[24]。

a-野生型與底物對接的相互作用力;b-突變體C189A-S251C與底物對接的相互作用力;c-野生型與底物對接的三維結構模擬;d-突變體C189A-S251C與底物對接的三維結構模擬圖9 野生型與突變體C189A-S215C的二維和三維結構模擬Fig.9 Structural simulation of wild type and its mutant C189A-S215C注:三維結構模擬中黃色棍棒結構代表底物,綠色虛線代表氫鍵,黃色虛線代表距離。

對于突變體C189A-S251C,二硫鍵的引入也可使其變得更加穩定。經過原子測距發現,突變之前,殘基SER A:251與CYS A:190之間的距離為3.4 ?,突變之后CYS A:190與CYS A:190兩個硫原子之間的距離為3.7 ?,空間距離適中,且由2.1.2節可知其他影響因素(如立體位阻、氨基酸埋藏深度等)都處于比較合理的數值,有利于二硫鍵的形成。因此,由較好的熱穩定性的提升推測,二硫鍵得以成功引入。

綜上所述,分子間相互作用的改變可能導致酶的內腔發生適當的變化,增強酶與底物的相互作用,從而提高結合效率和催化效率[25-27]。而二硫鍵的引入可以提高蛋白質結構的剛性,有利于酶熱穩定性的提高。

3 結論

本實驗通過結構模擬,針對突變能量的高低和二硫鍵預測分別構建了2個突變文庫,并實現了突變文庫之間的組合突變,一共對56種突變體進行了篩選,成功提升了該酶對底物ABTS的催化活性,同時較好地提高了該酶的熱穩定性,證明了該實驗策略的有效性和可靠性,為今后的突變改造策略提供了依據,避免了氨基酸突變選擇的盲目性。

結果表明,最終突變體C189A-S251C對底物的催化效率可達到野生型的5.3倍,并且在40 ℃的半衰期較野生型提高了1.2倍,同時提高了該酶在酸性環境下的耐受力,最適溫度和Tm值也有所上升,這一改造結果也為BlLac漆酶在生物技術和環境等領域的應用潛力提供了技術支持。