L-賴氨酸脫羧酶的表達、純化及其酶學性質研究

何世霞,謝文鵬,郭欣欣,呂育財,3,張文,3,楊瀟,3,龔大春,3*

1(湖北省生物酵素工程技術研究中心(三峽大學),湖北 宜昌,443002)2(三峽大學 生物與制藥學院,湖北 宜昌,443002)3(中國輕工業功能酵母重點實驗室(三峽大學),湖北 宜昌,443002)

近年來,隨著聚酰胺產品需求量在全球范圍內的迅速增長[1],戊二胺作為己二胺結構類似物[2],可與己二酸聚合制備性能優良的新型生物基聚酰胺PA56,可解決由石油為原料的化學生產制備己二胺所導致的能源短缺和環境污染等問題[3]。戊二胺應用廣泛,如在農業上,其作為“第二信使”可調節植物延緩衰老、促進植物開花結實[4-5]等;在醫藥領域,其可作為一種治療痢疾的有效藥物[6];還參與微生物細胞內鐵離子濃度的調節及關閉微生物蛋白通道等[7-9]。目前,利用微生物生產戊二胺已成為研究的熱點[10-11]。

賴氨酸脫羧酶是一種折疊型I型5′-磷酸吡哆醛依賴酶[12],催化L-賴氨酸生產戊二胺,存在于植物[13]、動物[14]和各種微生物中[15-19]。2011年,KANJEE等[20-21]發現pH值為5.5時,大腸桿菌CadA具有高催化活性,但在堿性條件下,CadA的催化活性和穩定性顯著降低,不利于戊二胺(強堿)的生產。2016年,李乃強等[22]對產酸克雷伯氏菌的賴氨酸脫羧酶進行異源表達并研究其酶學性質,結果表明,粗酶最適pH為5.5,隨著pH增加,酶活力逐漸降低。另外,鑒于已報道的賴氨酸脫羧酶對其酶學性質研究的尚不多見,因此,開展賴氨酸脫羧酶酶學性質的研究,不僅可以豐富數據庫,而且還為獲得具有堿性條件下穩定和高催化活性的賴氨酸脫羧酶,實現高產戊二胺奠定基礎。

本文主要通過克隆來源于大腸桿菌K12 MG1655中經過密碼子優化后的賴氨酸脫羧酶基因,將該基因在E.coliBL21(DE3)中進行異源表達,利用pET-28a(+)中的His標簽分離純化重組酶Ldc,并對其進行酶學性質研究。本研究將為后期該酶的分子改造及工業化生產應用提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)由本實驗室鑒定及保存;質粒載體pET-28a(+),上海生工生物工程有限公司;限制性內切酶BamH I和Hind III,美國New England Biolabs公司;質粒抽提試劑盒,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;DL10000 DNA Marker、蛋白質電泳Marker、6×loading Buffer、5×蛋白上樣緩沖液,TaKaRa有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG),純度>99.9%,Calbiochem公司;Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒,北京康為世紀生物科技有限公司;L-賴氨酸,上海源葉生物科技有限公司;乙腈(HPLC級,>99.99%),北京邁瑞達科技有限公司;丹磺酰氯,ACMEC/吉至生化公司;其他試劑為國產或進口分析純;PCR引物合成及測序由北京擎科生物科技有限公司武漢分公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組表達載體的構建及驗證

通過在蘇州金唯智公司進行全基因合成大腸桿菌K12 MG1655中賴氨酸脫羧酶基因序列,經過密碼子優化后,本文中涉及到的引物如表1所示,添加BamH I和Hind III酶切位點,將基因克隆至表達載體pET-28a(+),并轉化大腸桿菌BL21(DE3)中,轉化后,取適量菌液涂布在含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基平板上,37 ℃避光培養,挑取正確的克隆宿主進行培養,使用質粒抽提試劑盒提取重組質粒pET-28a(+)-Ldc(圖1),用內切酶進行雙酶切驗證,命名為重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-Ldc。

圖1 重組表達載體pET-28a(+)-Ldc結構示意圖Fig.1 Structural diagram of the recombinant expression vector pET-28a(+)-Ldc

表1 本研究使用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 重組菌株培養

挑取在卡那霉素抗性LB平板培養基上,含有重組表達質粒的單菌落接入含50 μg/mL卡那霉素的10 mL LB液體培養基中,37 ℃、200 r/min過夜培養,作為種子液。按OD600值為4的比例接種至100 mL搖瓶培養基中,23 ℃、200 r/min培養至OD600為0.6左右,加入IPTG使終濃度為0.5 mmol/L,23 ℃誘導16～18 h,表達目的蛋白。8 000 r/min離心10 min收集菌體細胞,用緩沖液洗滌后,-80 ℃備用。

1.2.3 賴氨酸脫羧酶Ldc純酶制備

所有的純化步驟均在冰水浴下進行。將離心收集的菌體細胞懸浮于緩沖液中(20 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L咪唑,0.5 mol/L NaCl,100 mmol/L PMSF,pH 7.2),超聲波破碎30 min(工作4 s,停6 s),4 ℃、10 000 r/min離心10 min取上清液。

粗酶液使用Ni-Agarose柱分離純化,將具有His標簽的目的蛋白上清液經0.45 μm濾膜過濾后上柱,分別用10倍柱體積Binding Buffer(20 mmol/L Tris-HCl,20～500 mmol/L咪唑,0.5 mol/L NaCl,pH 7.2)進行洗雜洗脫,并按每1 mL流出液分管收集,保存于4 ℃備用。蛋白樣品經SDS-PAGE檢測,記錄并分析結果。

1.2.4 蛋白的分析與測定

重組蛋白分析采用SDS-PAGE[23],考馬斯亮藍R-250染色顯示蛋白條帶;采用Bradford法[24]測定蛋白濃度。

1.2.5 重組酶Ldc活力測定方法

采用高效液相色譜儀定量檢測賴氨酸脫羧酶的酶活力。測定方法:總反應體積1 mL,包括600 μL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)及200 μL 25 mmol/LL-賴氨酸緩沖液,加入5′-磷酸吡哆醛至終濃度為0.1 mmol/L,溫育5 min,最后加入100 μL純酶液,在37 ℃反應30 min,煮沸5 min終止反應,離心取上清液進行衍生反應,HPLC測定戊二胺生成量。酶活力定義:在37 ℃、pH 7.0條件下,每1 min催化生成1 μmol戊二胺所需的酶量定義為1 U。并按公式(1)計算酶活力:

(1)

式中:c,戊二胺的濃度,μmol/L;V總,總反應體積,mL;t,反應時間,min;V,酶液添加體積,mL。

1.2.6 戊二胺測定方法

參照文獻[25]的方法,稍加修改。取400 μL待測樣品溶液于2 mL容量瓶中,加入40 μL 2 mol/L NaOH溶液和120 μL飽和NaHCO3溶液,振蕩10 s,加入800 μL丹磺酰氯溶液,振蕩混勻,40 ℃避光反應45 min。衍生反應完畢后,在混合液中加入40 μL氨水,混勻,靜置30 min進行終止反應,用乙腈定容,振蕩混勻,用2 mL注射器吸取適量溶液,0.22 μm濾膜過濾至進樣小瓶中,HPLC測定。

色譜柱C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相V(乙腈)∶V(0.1 mol/L乙酸銨)=8∶2;柱溫35 ℃;流速1 mL/min;檢測波長254 nm;進樣量20 μL。

1.2.7 重組酶Ldc的酶學性質研究

1.2.7.1 重組酶Ldc的pH穩定性考察

分別將純酶液溶解于pH 4.0～10.0(pH 4.0、5.0、5.7、6.0采用檸檬酸-檸檬酸鈉體系;pH 7.0、8.0采用磷酸鹽體系;pH 9.0、10.0采用甘氨酸-NaOH體系)的100 mmol/L緩沖液中,37 ℃保溫2 h,按照1.2.5節的方法測定不同pH值下賴氨酸脫羧酶Ldc的相對酶活力,考察此酶的pH穩定性。

1.2.7.2 重組酶Ldc的溫度穩定性考察

取適量純酶液,采用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液,置于20～80 ℃條件下保溫2 h,按照1.2.5節的方法測定不同溫度下賴氨酸脫羧酶Ldc的酶殘留活性,考察溫度對酶穩定性的影響。

1.2.7.3 不同金屬離子對純酶酶活力的影響

在反應體系中分別加入終濃度為5 mmol/L的金屬離子(Mn2+、Mg2+、Co2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Ca2+),測定相對酶活力,研究金屬離子對賴氨酸脫羧酶的影響,以不加金屬離子的作為空白對照。

1.2.7.4 重組酶Ldc的動力學參數Km、Vmax、kcat和催化特異性常數kcat/Km測定

在Ldc最適pH值下的酶反應體系中加入0.25～1.25 mmol/L等不同濃度的L-賴氨酸,測定在一定時間(保證酶的催化處于一級動力學范圍內)內生成戊二胺的量,以此來計算賴氨酸脫羧酶的反應速率。利用Lineweaver-Burk雙倒數作圖,計算出此酶的Km、Vmax值。依據1.2.4節的方法測定酶的蛋白含量。酶的轉換數kcat是一個催化常數,可以根據公式kcat=Vmax/[Et]計算得出。其中,[Et]表示酶的初始總濃度。kcat/Km值是衡量酶的催化效率參數,又稱特異性常數。

2 結果與分析

2.1 賴氨酸脫羧酶Ldc在大腸桿菌中的誘導表達與重組酶的純化

2.1.1 重組質粒pET-28a(+)-Ldc的驗證

對正確的陽性克隆重組質粒pET-28a(+)-Ldc經BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切,1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析,結果如圖2所示,可見有2條帶,一條為載體片段,約5.3 kb;另一條為目的基因片段,約2.1 kb,插入的外源片段大小與預期相符,全長為2 148 bp,包含715個氨基酸的編碼序列。

M-DL 10000 DNA Marker;1,2-BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切重組質粒pET-28a(+)-Ldc圖2 重組質粒pET-28a(+)-Ldc的酶切電泳圖譜Fig.2 Digestion electrophoresis of the recombinant expression plasmid pET-28a(+)-Ldc

2.1.2 咪唑洗脫濃度的探索

將濕菌體細胞超聲波破碎后進行SDS-PAGE檢測蛋白表達情況。由于目的蛋白N端融合的His-Tag與咪唑可以競爭性結合在氮基三乙酸表面,因此通過改變咪唑濃度,可以調節蛋白質在鎳柱上的結合或洗脫。使用Ni-Agarose柱,并采用不同咪唑濃度(50、100、200、300、400、500 mmol/L)的緩沖液進行洗脫并收集洗脫液。由圖3可知,50 mmol/L咪唑緩沖液能洗下大部分雜蛋白和目的蛋白,咪唑緩沖液濃度在200 mmol/L時洗出全部目的蛋白。因此,采用含有20 mmol/L咪唑的緩沖液充分洗滌雜蛋白,然后再使用200 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白。此外,誘導的重組菌破碎的上清液和沉淀中均出現蛋白條帶,結合Ldc的蛋白質數據,則為81.2 kDa,由此可知,該賴氨酸脫羧酶在宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)中表達成功,但少部分以包涵體形式不可溶表達。

M-蛋白Marker;1-粗酶液;2-誘導重組菌破碎沉淀;3-鎳柱流穿液;4～9:50、100、200、300、400、500 mmol/L咪唑洗脫液圖3 目的蛋白Ldc咪唑洗脫結果Fig.3 Imidazole elution of the Ldc protein

2.1.3 目的蛋白SDS-PAGE檢測

采用1.2.2節重組菌株誘導培養的濕菌體細胞,按照1.2.3節的方法經Ni-Agarose柱親和層析純化后,與重組菌菌體破壁上清液相比,純化后的目的蛋白條帶較單一(圖4泳道5)。洗脫液總蛋白含量為15.99 mg,比酶活力為0.56 U/mg。

M-蛋白Marker;1-粗酶液;2-鎳柱流穿液;3,4-鎳柱洗雜液;5-洗脫液圖4 重組蛋白純化樣品的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE pattern of the recombinant protein

2.2 重組酶Ldc的酶學性質研究

2.2.1 重組酶Ldc的pH穩定性考察

本研究考察重組酶Ldc在pH 4.0～10.0的純酶酶活力變化。由圖5可知,重組酶Ldc在pH 5.7～8.0,相對酶活力保持80%上,說明該酶穩定性較好,具有很好的pH適應性。在pH低于5.7和高于8.0條件下,重組酶相對酶活力下降較快,表明在實際操作中要控制好催化環境的酸堿性。KIM等[26]報道來自肺炎克雷伯菌的賴氨酸脫羧酶LdcC也采用His標簽表達重組得到,其酶pH穩定范圍較窄,最穩定的pH值為7.0。重組酶Ldc耐酸堿性的能力為該酶的分子改造提供了依據。

圖5 重組酶Ldc的pH穩定性Fig.5 pH stability of the recombinant carbonyl reductase Ldc

2.2.2 重組酶Ldc的溫度穩定性考察

由圖6可知,該酶在20～60 ℃的溫度范圍內穩定性很好,相對酶活力保持在80%以上,但溫度達到60 ℃以上,酶穩定性下降很快,圖6顯示,重組酶T50值為72 ℃,經驗證,72.1 ℃時重組酶活力降低為原來的50%,表明該酶的耐熱穩定性較好。OSIRE等[27]報道來自氧化葡糖桿菌DSM3504的賴氨酸脫羧酶(GoLDC)采用His-TrapTMHP色譜柱的AKTA Prime系統純化蛋白,其酶的溫度穩定性范圍跟本研究基本一致,最適溫度為30 ℃。

圖6 重組酶Ldc溫度穩定性Fig.6 Temperature stability of the recombinant carbonyl reductase Ldc

2.2.3 金屬離子對重組酶Ldc活性的影響

很多酶促反應需要金屬離子作為輔因子,因此在酶促反應中經常添加某金屬離子來促進或抑制酶促反應的進行。由圖7可知,賴氨酸脫羧酶的酶活力在一定濃度下受金屬離子的影響較大。在終濃度為5 mmol/L條件下,除Mg2+和Ca2+外,其他5種金屬離子均對賴氨酸脫羧酶具有抑制影響。抑制作用最明顯的是Cu2+,其次是Ni2+。而Mg2+和Ca2+對賴氨酸脫羧酶有微弱的激活作用。楊穎等[28]研究發現,屬于肺炎克雷伯桿菌屬的菌株GXW-1在5 mmol/L的Cu2+作用下,強烈抑制了酶活性,相對酶活力下降到初始酶活力的20%以下,這與本研究結果大體一致。因此,我們認為賴氨酸脫羧酶可能存在結合位點能夠與這些金屬離子結合,從而改變了酶的構象并影響了酶的活性。

圖7 金屬離子對重組酶Ldc活力的影響Fig.7 Effect of metal ions on the activity of Ldc

2.2.4 重組酶Ldc的動力學參數及催化特性參數

在酶促反應體系中設定不同的L-賴氨酸濃度梯度,在一定反應時間內使其成為酶促反應的限制因素。利用Lineweaver-Burk雙倒數作圖,計算出此酶的Km為0.011 mol/L,Vmax值為0.643 mmol/(L·min),比活力為0.56 U/mg,酶的轉換數kcat經計算為0.23 s-1,kcat/Km值為20.91 L/(mmol·s)。

3 結論

本實驗在大腸桿菌BL21(DE3)中成功實現了經過密碼子優化的大腸桿菌K12 MG1655中賴氨酸脫羧酶Ldc基因的異源表達。結果表明,該賴氨酸脫羧酶Ldc的基因序列全長2 148 bp,編碼715個氨基酸,重組酶分子質量大小在81.2 kDa左右。采用Ni-Agarose親和層析對重組酶Ldc分離純化后,對底物L-賴氨酸的比活力為0.56 U/mg。重組酶Ldc適宜pH范圍在5.7～8.0,隨著戊二胺的生產,有利于在生產過程中,減少酸性緩沖液的加入,既節省試劑,又利于后期產品純化和提高產品質量,此外,還可通過分子定向進化進一步提升其適應范圍。重組酶Ldc在60 ℃以下穩定性很好,相對酶活力保持在80%以上,但隨著溫度的升高,酶穩定性下降很快。常見金屬離子實驗表明,Cu2+對該酶的抑制作用最強,Mg2+和Ca2+卻有微弱的激活作用。后期將對該酶進行分子改造,篩出高酶活力的突變菌株,并研究其酶學性質及產物戊二胺的初步分離純化,為工業化生產及應用提供重要的基礎數據。