不同液化pH對發酵生產玉米酒精的影響

王祥余,范文榜,李麗,宗緒巖*,李陽源*

1(廣東溢多利生物科技股份有限公司,國家認定企業技術中心,廣東 珠海,519000)2(四川輕化工大學 生物工程學院,釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室,四川 宜賓,644000)

酒精的主要用途為燃料乙醇、食用酒精、化工和醫藥消毒酒精[1]。據美國可再生能源燃料協會(Renewable Fuels Association, RFA)統計2020年美國、巴西、歐盟和中國為世界上酒精產量最多的國家和地區[2]。根據中國酒業協會酒精分會統計2021年全國83家規模以上酒精企業總產量為946萬t,同比2020年下降6.82%[3]。從2019年開始隨著玉米、小麥等糧食價格的迅速上漲[3-4]、酒精價格的漲幅不及預期[3-4]及國家對酒精行業補助減少乃至取消[5],我國酒精行業產量已連續4年萎縮[3],大多數企業陷入虧損狀態[3]。為了企業生存,酒精科研人員積極開展研究以求降本增效。在原料方面,LI等[6]總結了玉米、小麥、高粱、大麥、木薯、稻谷等原料在酒精生產中的效果;APPIAH-NKANSAH等[7]研究了高粱制作酒精的工藝條件;陳大鵬等[8]研究了糙米、玉米、小麥等原料的酒精發酵工藝。在發酵技術方面,ZHANG等[9]研究利用同步糖化發酵(simultaneous saccharification and fermentation, SSF)技術發酵甘薯生產酒精;武國慶等[10]嘗試使用半連續發酵提高稻谷燃料乙醇的生產能力。在酵母培養方面,LI等[11]研究了高濃酒精發酵條件下氮源使用問題,并嘗試用低成本的尿素、(NH4)2SO4等替代部分價格昂貴的酵母抽提物;DLAMINI等[12]研究了游離氨基氮對酒精發酵過程的影響。在酶制劑應用方面,吳偉偉等[13]驗證了酸性蛋白酶在玉米發酵酒精能力提升方面的價值;TIEN等[14]闡述了酸性蛋白酶在以大米為原料的生料酒精發酵中提高酒精產率、縮短發酵周期的功能;2020年馮鵬[15]闡述了諾維信的低pH淀粉酶和復配糖化酶設計原理和應用效果;2011年居乃琥[16]闡述了諾維信在不依賴鈣離子淀粉酶和熱穩定糖化酶方面的應用研究。在節能方面,孟華等[17]在2020年酒精年會會刊上闡述了酒精蒸餾工段的綜合節能設計。

近年來,隨著陳化糧[14]和問題糧[18]被廣泛應用于酒精生產,同時發酵清液回配成為酒精企業運行的強制要求[11],酒精液化醪pH已難維持在5.4～5.8,越來越多的酒精企業液化醪pH降低至5.0甚至4.8[15,19]。但降低液化pH值對酒精生產的影響卻因為太過簡單而普遍不被重視,各個生產企業多以經驗來控制液化pH。為了解液化pH對酒精生產的影響,本文基于玉米酒精同步糖化發酵模型考察不同液化pH條件下玉米酒精生產情況,以期提高酒精生產指標并降低糧耗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉,山東省夏津縣富民小米生產農民專業合作社。

耐高溫α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶,溢多利生物科技股份有限公司,酶活力為196 771和364 293 U/mL;發利釀酒高活性干酵母(Fali Yeast耐高溫型),益海嘉里英聯馬利投資有限公司。

1.2 儀器與設備

MB-800自動糖化儀,廣東嘉儀儀器集團有限公司;NDJ-5S黏度計,上海平軒科學儀器有限公司;GC-2010 Plus氣相色譜,日本島津公司;J&W DB-WAX UI超高惰性柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),安捷倫科技(中國)有限公司;水分分析儀MB23,豪奧斯(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米粉樣品處理

水分測定參考GB/T 10362—2008《糧油檢驗 玉米水分測定》;淀粉含量測定參考GB 5009.9—2016《食品安全國家標準 食品中淀粉的測定》和Megazyme[7]試劑盒,以本實驗使用的溢多利酶代替原試劑盒酶制劑。

1.3.2 耐高溫α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶樣品處理

耐高溫α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶酶活力測定參考GB 1886.174—2016《食品安全國家標準 食品添加劑 食品工業用酶制劑》。

1.3.3 建立同步糖化發酵玉米酒精模型

同步糖化發酵玉米酒精模型如圖1所示。

圖1 同步糖化發酵玉米酒精模型Fig.1 Corn SSF ethanol production model

配料:實驗規模(玉米漿)150 g,干物濃度(dry solid,DS)25%。玉米漿的pH使用稀H2SO4溶液調整,根據目前國內玉米酒精工廠生產工藝特點,玉米漿pH選擇4.8、5.2和5.6做考察點[15,19]。

液化還原糖:DNS法略作修改[9]。液化醪碘試:液化醪稀釋10倍后于4 000 r/min離心5 min,取上清液100 μL加入5 mL純凈水,加40 μL濃碘液混勻顯色。液化醪黏度測定:需降溫至32 ℃后測定其黏度。

酒精發酵周期:目前國內玉米酒精發酵周期一般為64～72 h,而本實驗研究酸性液化條件下酒精發酵情況,因此酒精發酵周期延長至144 h[7]。發酵期間記錄發酵CO2失重[8,11,13]。發酵結束檢測發酵成熟醪的殘還原糖、殘總糖、殘過濾總糖、殘淀粉和殘糊精含量,方法參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》及Q/JRY103.309.05—2019《吉林燃料乙醇操作標準 分析標準》[9,20]。

乙醇的測定:發酵成熟醪12 000 r/min離心10 min,取上清液,過0.45 μm濾膜,4 ℃冰箱保存。氣相色譜條件:進樣體積0.5 μL,分流比1∶120;氣化室溫度230 ℃,檢測器溫度240 ℃。升溫程序:35 ℃保持5 min;以5 ℃/min升至100 ℃,維持5 min;以15 ℃/min升至200 ℃。

1.3.4 計算公式

1.3.4.1 噸酒糧耗

噸酒糧耗(即每生產1 t酒精消耗的玉米質量)按公式(1)計算[13,21]:

(1)

式中:DS,拌料的干物濃度,%;Alc,酒份,g/100 g成熟醪;Aw,玉米粉的含水量,%。

1.3.4.2 成熟醪殘淀粉含量

成熟醪殘淀粉含量按公式(2)計算[11]:

成熟醪殘淀粉/(g/100 g成熟醪)=(TRS-TFRS)×0.9

(2)

式中:TRS(total residual sugar content),殘總糖,g/100 g成熟醪;TRFS(total filtered residual sugar content),殘過濾總糖,g/100 g成熟醪;0.9,葡萄糖與淀粉的轉化系數。

1.3.4.3 成熟醪殘糊精含量

成熟醪殘糊精含量按公式(3)計算[11]:

成熟醪殘糊精/(g/100 g成熟醪)=(TFRS-RRS)×0.9

(3)

式中:TRS,殘總糖,g/100 g;RRS(residual reducing sugar content),殘還原糖,g/100 g成熟醪;0.9,葡萄糖與糊精的轉化系數。

1.3.4.4 淀粉酒精轉化率

淀粉酒精轉化率(Y)按公式(4)計算:

(4)

式中:Y,每克淀粉生產酒精質量或者每噸淀粉生產酒精質量;V,成熟醪體積,mL;S,每個發酵瓶中的玉米粉含有的絕干淀粉量,g;Alc,酒份,g/100 g成熟醪。

1.3.4.5 酒精發酵效率

酒精發酵效率(E)按公式(5)計算:

(5)

式中:V,成熟醪體積,mL;S,每個發酵瓶中的玉米粉含有的絕干淀粉量,g;Alc,酒份,g/100 g成熟醪;0.57,淀粉到酒精的轉化系數。

1.3.5 數據處理

玉米成分分析每個實驗重復6次;發酵實驗每個實驗重復3次,每次樣品檢測2次。采用Excel 2013和GraphPad Prism 8.0對數據進行處理、繪圖和顯著性分析,P>0.05差異不顯著,P<0.05差異顯著,P<0.01差異極顯著,數據以(平均值±標準差)的形式表示(n=6)。

2 結果與分析

2.1 玉米成分分析

如表1所示市售玉米粉平均含水量為(12.48±0.08)%。為避免纖維素、半纖維等對淀粉分析的干擾,采用酶法對淀粉進行測定,結果為(74.42±0.76)%。本文玉米粉的淀粉含量明顯高于郭孝孝等[4]的59.1%及賈樹彪等[1]的65%～73%,表明本文使用的玉米粉質量較好,這對降低噸酒糧耗有顯著的幫助[9,11]。

表1 玉米粉化學成分分析Table 1 Chemical compositions analysis of corn flour

實驗中每個發酵瓶中液化醪質量為150 g,DS=25%,接種時引入酒母活化醪質量為3 g(20%為液化醪,80%為純凈水)。因此每個發酵瓶液化醪為150.6 g,含玉米粉約43.02 g;絕干淀粉S約32.01 g。

2.2 不同液化pH對液化工段的指標影響

2.2.1 不同液化pH對液化還原糖的影響

如圖2所示不同液化pH條件下液化還原糖的標準差較小,表明該模型表現穩定;另外證明不同液化pH對耐高溫α-淀粉酶的性能有明顯影響(P<0.01),特別是在pH為4.8～5.2。上述數據證明保持液化pH≥5.2的必要性。同時也表明在原料品質下降的條件下[10]酒精行業對具有良好耐酸特性的耐高溫α-淀粉酶的需求[15-16],這種淀粉酶可提高清液回配量、減少能源消耗、降低生產污水排放[19,21]。

圖2 不同pH值液化條件下液化還原糖分析Fig.2 Effect of pH on reduced sugars in different liquefied corn mash注:ns,無顯著差異;*,差異顯著;**,差異極顯著;顯著性分析方法Ordinary one-way ANOVA(n=3)(下同)。

2.2.2 不同液化pH對液化醪黏度的影響

如圖3所示,在不同液化pH條件下液化醪黏度標準差較小且差異明顯,結果表明較高的液化pH可顯著提高耐高溫α-淀粉酶的降黏效果,特別是在pH為4.8～5.2(P<0.01)。

圖3 不同pH值液化條件下液化醪黏度分析Fig.3 Effect of pH on the viscosity of liquefied corn mash

2.2.3 不同pH值液化條件下玉米粉液化碘試分析

如圖4所示,液化碘試顏色隨著液化pH的提高,液化碘試顏色逐步變淺。結果表明在pH 4.8～5.6,隨著液化pH的提高,耐高溫α-淀粉酶切割淀粉所得的糊精越均勻,液化效果越好。

圖4 不同pH值液化條件下玉米粉液化碘試分析Fig.4 Effect of different liquefied corn mash pH on liquefied mash iodine test注:左起分別為空白對照、液化pH 4.8、液化pH 5.2、液化pH 5.6。

綜合圖2～圖4分析可知,在pH 4.8～5.2,特別是在pH 5.2～5.6,隨著液化pH的提高,耐高溫α-淀粉酶的應用效果得到迅速的提升。證明控制液化pH≥5.2是發揮耐高溫α-淀粉酶性能的關鍵,同時也從側面表明耐酸性能良好的新一代耐高溫α-淀粉酶對酒精工業的價值。

2.3 不同液化pH對發酵過程指標的影響

如圖5-a所示,在酒精發酵過程中模型穩定性良好,最大標準差分別僅為0.42、0.55和0.38;同時在液化pH 4.8～5.6,隨著液化pH值提高,CO2失重速率顯著下降,但隨著酒精發酵時間延長,CO2失重總量最終趨于一致。結合圖2分析可知,CO2失重速率下降是發酵初期的液化還原糖較高形成高滲透壓抑制酵母生長、繁殖導致[6,11,22],同時本文使用SSF在一定程度減輕了這一現象。

a-不同發酵時間;b-不同液化醪pH圖5 不同pH值液化條件下的玉米酒精發酵模型表現Fig.5 Model of corn ethanol production from liquefied mash at different pH

如圖5-b所示,發酵失重最高的是液化pH 4.8,比液化pH 5.2和pH 5.6時分別高0.46%(P>0.05)和1.00%(P<0.05)。考慮到大生產中酒精發酵時長一般不超過72 h[8,20],本文以72 h為發酵終點,以液化pH 4.8為對照組,其比液化pH 5.2和pH 5.6的CO2失重分別高0.94%(P>0.05)和1.08%(P>0.05)。數據表明在發酵72 h時3組實驗均未達到發酵終點,發酵初期的糖抑制現象始終存在,只是液化pH 4.8條件下耐高溫α-淀粉酶性能受抑制而使糖抑制現象不明顯。同時如圖3所示,在實驗中液化pH 4.8條件下液化醪黏度非常大,已形成了半固體膏狀玉米糊(數據略),無法滿足正常的管道運輸要求。總之,在實際酒精生產過程中控制液化pH≥5.2是使用高溫α-淀粉酶所必需的。

2.4 不同液化pH對發酵指標的影響

如圖6-a所示,液化pH 5.6的酒份比pH 5.2和4.8的高0.32%(P>0.05)和1.18%(P<0.05),與圖5表現完全相反,原因是較高的液化還原糖導致了如甘油、海藻糖等大量副產物的產生[6,11,22]。按照6 800元/t酒精計算,30萬t/年酒精廠在液化pH 5.6條件下比pH 4.8每年多生產酒精3 540 t,價值2 470萬元,表明控制合適液化pH很有必要,同時也證明耐酸性的耐高溫α-淀粉酶對酒精工業的價值。

a-乙醇;b-殘總糖;c-殘淀粉;d-殘過濾總糖;e-殘糊精;f-殘還原糖圖6 不同液化pH對發酵成熟醪指標的影響Fig.6 Effect of different liquefied corn mash pH on main indexes of mature fermented mash

綜合圖5-b CO2失重并考慮到發酵體系質量為153 g以及成熟醪密度0.978 0 g/mL,可得發酵成熟醪體積(V)分別為VpH 4.8=140.88 mL、VpH 5.2=140.95 mL和VpH 5.6=141.03 mL。參考圖6-a發酵成熟醪酒精含量可得淀粉酒精轉化率(Y)分別為:YpH 4.8=0.547 0 t/t;YpH 5.2=0.552 1 t/t和YpH 5.6=0.552 9 t/t。每克淀粉理論可生產酒精0.57 g[11],則不同液化pH的酒精發酵效率(E)分別為:EpH 4.8=96.44%;EpH 5.2=97.34%和EpH 5.6=97.42%。發酵效率表明,在液化pH 4.8～5.6,隨著液化pH的提高酒精發酵效率也會提高,這與2.2節的液化醪指標分析結果相吻合,另外也進一步印證了2.3節的分析結論。根據圖6-a酒精質量可得液化pH 4.8、5.2、5.6條件下噸酒糧耗分別為2.457、2.434和2.431 t,表明適合于耐高溫α-淀粉酶性能發揮的液化pH可以節約噸酒糧耗,再次證明耐酸性的耐高溫α-淀粉酶對酒精工業的價值。

如圖6-c所示,液化pH 5.6條件下成熟醪殘淀粉含量比pH 5.2和 4.8分別低0.66%(P>0.05)和5.26%(P<0.05)。結果證明,越適合耐高溫α-淀粉酶性能發揮的液化pH越能提高原料中淀粉酶的利用率,從而提高糧食利用率,與圖6-a和圖6-b的結果分析相一致。

綜合分析圖6在pH 4.8～5.6,隨著液化pH的提高,成熟醪中小分子糖類(過濾總糖、殘糊精、殘還原糖等)得到同步提高,而如殘淀粉含量卻在下降。結合2.2節和2.3節分析可知是發酵初期較高的糖濃度造成的,可以通過添加優化發酵工藝[9-10]、使用合適的氮源[11-12]和添加酸性蛋白酶解決[13-14]。

3 結論

本文以同步糖化發酵玉米酒精模型為研究工具考察不同的液化pH對玉米酒精生產的影響,結果表明:構建的同步糖化發酵玉米酒精模型穩定性良好,所得數據準確可靠。

在液化pH 4.8～5.6時,特別是在pH 4.8～5.2,隨著液化pH提高耐高溫α-淀粉酶的性能得到明顯提升。以30萬t/年酒精廠為例,在液化pH 5.6條件下比pH 4.8每年增產酒精3 540 t,價值2 470萬元。上述總結證明了控制液化pH≥5.2的必要性,同時證明耐酸性耐高溫α-淀粉酶在酒精工業具有較大的應用價值。

在較高的拌料DS、較高的耐高溫α-淀粉酶使用劑量或者較適宜的使用條件下,酒精發酵初期糖濃度會因液化還原糖較高而變高,容易形成較高的滲透壓,從而影響發酵的速率,導致發酵不徹底,增加噸酒糧耗。因此在酒精生產中需要注意液化還原糖和發酵初期的糖濃度,同時配合使用適量的氮源、酸性蛋白酶和優化酒母擴培工藝,以提高發酵效率和糧酒轉化率,節約糧食,提高企業生產利潤。