Plastein反應修飾對核桃血管緊張素轉化酶抑制肽活性及穩定性影響研究

曹詩諾,陳宇,韓澤玉,侯雪瑩,唐明建,王豐俊

(北京林業大學 生物科學與技術學院,林業食品加工與安全北京市重點實驗室,北京,100083)

核桃(JuglansregiaL.)別稱胡桃,是胡桃科經濟作物。2020年我國核桃產量達到479.59萬t,居世界首位[1]。核桃含有豐富的脂肪、蛋白質等營養物質。核桃肽主要通過化學法、酶法降解或微生物發酵制備而成。核桃肽消化吸收性能好、安全性高,而且還具有多種生理調節功能,如抗氧化、免疫調節、降血壓、降血糖和降血脂等[2-3]。

Plastein反應又稱類蛋白反應,為蛋白酶存在下,其水解反應的逆反應[4]。Plastein反應產物制備分為3步:水解、濃縮和合成。Plastein反應為第3步,即合成,其可以用于減少蛋白酶解液的苦味[5],修飾活性肽以提高肽的生物活性,如抗氧化活性、血管緊張素轉化酶(angiotensin Ⅰ converting enzyme,ACE)抑制活性。UDENIGWE等[6]利用類蛋白反應,使酪蛋白的鐵還原潛能顯著增加(P<0.05);高丹丹等[7]通過Plastein反應修飾使馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的抑制率提高了1.35倍。Plastein反應還用于改善牡蠣[8]、南瓜籽[9]酶解物的ACE抑制活性。目前未發現將Plastein反應用于核桃ACE抑制肽的修飾。

本研究利用Plastein反應對核桃ACE抑制肽進行修飾,研究了底物濃度、反應溫度、反應時間以及添加外源氨基酸對該反應的影響,以提高ACE抑制肽的活性。探究了離子濃度、溫度和變性劑濃度對Plastein產物結構穩定性的影響,采用圓二色光譜和X-射線衍射分析研究Plastein反應產物的結構信息,并和未修飾的ACE抑制肽進行對比分析,探究Plastein反應對ACE抑制肽結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃分離蛋白,實驗室前期制備;堿性蛋白酶(200 U/mg),上海源葉生物科技有限公司;中性蛋白酶(60 000 U/g)、苯丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸,北京藍弋科技有限公司;ACE、馬尿酰組氨酰亮氨酸(N-hippuryl-his-leu hydrate, HHL),美國Sigma公司;乙腈(色譜純),天津市康科德科技有限公司;其他試劑均為分析純。

新芝-12N型冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司;HC-2518R型高速冷凍離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司;VivaFlow超濾膜包,德國賽多利斯公司;LC-2010A HT型高效液相色譜,日本島津公司;L6型紫外可見分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;Jasco-815型圓二色譜儀,Jasco日本分光公司;D8 ADVANCE型X-射線衍射儀,德國布魯克AXS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃ACE抑制肽的制備

參照JIN等[10]的方法并稍作修改。將核桃蛋白加入去離子水使質量濃度為50 g/L,調節pH為9.5,加入5% (質量分數)堿性蛋白酶,在55 ℃下酶解3 h。滅酶后調節pH為7.0,加入4.17%(質量分數)中性蛋白酶,在45 ℃下酶解1.5 h,滅酶。離心收集上清液,上清液過超濾膜,得到<5 kDa的核桃多肽,將濾液冷凍干燥后置于-20 ℃冷藏儲存備用。

1.2.2 水解度測定

采用甲醛滴定法。調整酶解液pH為7.0,之后加入甲醛溶液,混合均勻。使用NaOH溶液滴定至pH 9.2,消耗NaOH溶液體積記為V1。取相同濃度的未水解的蛋白溶液,做空白試驗,消耗的NaOH溶液體積記為V2。水解度的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:c,NaOH溶液的濃度,mol/L;ρ,所用酶解液的蛋白質量濃度,g/L;V,酶解液的體積,mL;Htot,每克原料蛋白中肽鍵物質的量,mmol,其中核桃蛋白的Htot為8.0 mmol/g。

1.2.3 ACE抑制肽體外ACE抑制率測定

參考SANGSAWAD等[11]的方法。取待測溶液40 μL,加入20 μL的ACE溶液(0.1 U/mL),37 ℃保溫5 min后加入50 μL的HHL溶液反應60 min。之后加入HCl溶液終止反應。使用硼酸鹽緩沖液代替待測溶液重復以上步驟作為空白對照。使用高效液相色譜測定樣品中馬尿酸的峰面積。根據公式(2)計算ACE抑制率:

(2)

式中:a,空白對照組中的馬尿酸的峰面積;b,添加抑制劑組中的馬尿酸的峰面積。

1.2.4 Plastein反應修飾ACE抑制肽

參照XU等[12]的方法,并略作修改。配制一定底物質量分數的核桃多肽溶液,調節pH為9.0,加入核桃多肽質量分數2%的堿性蛋白酶。以混合物的游離氨基酸減少量及ACE抑制率為指標,探究底物濃度、反應溫度和反應時間對Plastein反應的影響。

1.2.5 添加外源氨基酸的Plastein修飾反應

按照1.2.4節中得到的Plastein反應條件進行反應,并在體系中分別添加亮氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸,制備外源氨基酸存在下的Plastein反應修飾物,并分別測定修飾產物的游離氨基酸減少量及ACE抑制率。

1.2.6 游離氨基酸含量測定

采用鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)法[8]。在340 nm處測定吸光值,繪制標準曲線y=0.016 89x+0.001 48,R2=0.999 7。在相同條件下測定樣品吸光值,通過標準曲線計算樣品中的游離氨基酸含量。樣品游離氨基酸的減少量(μmol/g)=反應前游離氨基酸含量-反應后游離氨基酸含量。

1.2.7 Plastein反應驗證實驗

在相同濃度下測定不同修飾物的ACE抑制率,并且與修飾前的ACE抑制肽作比較。

1.2.8 Plastein反應產物結構穩定性實驗

1.2.8.1 溫度穩定性

參考DOUCET等[13]的方法,略作修改。將Plastein反應產物配成質量濃度為5 mg/mL的溶液,分別在0、20、40、60、80、100 ℃下保溫5 min,在420 nm下測定溶液的濁度。

1.2.8.2 離子穩定性

參考JIANG等[14]的方法,并略作修改。分別用不同濃度梯度的NaCl溶液將Plastein反應產物配制成5 mg/mL的溶液,靜置5 min,在420 nm下測定溶液的濁度。空白對照分別為相應濃度的NaCl溶液。

1.2.8.3 變性劑的影響

參考JIANG等[14]的方法,并略作修改。分別用不同濃度梯度的尿素溶液和十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液將Plastein反應產物配制成5 mg/mL的溶液,振搖,添加SDS的溶液室溫下靜置20 min。在420 nm下測定溶液的濁度。

1.2.9 圓二色譜分析

溶液質量濃度為0.2 mg/mL,石英比色皿光程為10 mm;實驗參數:掃描波長190～400 nm,掃描速度50 nm/min,分辨率0.1 nm,帶寬1.0 nm,每個樣品掃描3次,取平均值。

1.2.10 X-射線衍射分析

實驗參數:輻射源Cu-Kα,靶電壓40 kV,管電流40 mA,掃描速度5 °/min,掃描范圍5°～90°。連續掃描得到樣品的X射線衍射圖譜。

1.2.11 數據分析

所有實驗測定次數至少為3次,采用Excel 2010、Origin Pro 9.1軟件對數據進行分析。運用SPSS 17.0做方差分析(analysis of variance,ANOVA),不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 Plastein反應修飾ACE抑制肽

2.1.1 底物質量分數對Plastein反應的影響

Plastein反應的底物質量分數相對酶解反應較大,有利于發生縮合和轉肽反應[15]。如圖1-a所示,當底物質量分數從30%增加到50%時,Plastein反應修飾物的游離氨基酸的減少量呈先上升后下降的趨勢,底物質量分數為35%時最大,此時游離氨基酸減少量為185.05 μmol/g。原因是底物濃度太低,則游離氨基酸的量處于較低水平,并且酶的水解作用起主導作用,不利于反應的進行[16];當底物質量分數過大時,反應混合物會聚結,這可能導致底物與堿性蛋白酶的接觸面積減小,從而阻礙堿性蛋白酶對反應催化效率的提升[9]。反應產物的ACE抑制率也呈現先上升后下降的趨勢,產物ACE抑制率達到最高時為88.55%。考慮節省原料,因此選用的最佳底物質量分數為35%。

a-底物質量分數;b-反應溫度;c-反應時間圖1 反應條件對Plastein反應產物ACE抑制率和游離氨基酸含量的影響Fig.1 Effect of reaction conditions on ACE inhibitory rate and free amino acids content of Plastein reaction products

2.1.2 反應溫度對Plastein反應的影響

活性蛋白酶對于催化Plastein反應很重要。如圖1-b所示,本次實驗中使用的堿性蛋白酶最適反應溫度為40～55 ℃,但較低的溫度會對反應有利,因為Plastein反應是放熱反應[17]。當反應溫度為30 ℃時,反應修飾物的ACE抑制率和游離氨基酸減少量最高,分別為89.06%和102.68 μmol/g。高丹丹等[7]在研究Plastein反應對馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的影響時發現,隨著溫度升高,經修飾后的ACE抑制肽的ACE抑制率會呈現先上升后下降的趨勢,當溫度為42 ℃時,ACE抑制率達到最大值。這與本研究中ACE抑制率的變化趨勢一致。JIANG等[14]選用胰蛋白酶的Plastein反應溫度為45 ℃。當反應溫度由40 ℃升到60 ℃時,反應修飾物的ACE抑制率小幅增加,可能是由于溫度達到堿性蛋白酶最適反應溫度,因此反應初始速度較快,使得產物ACE抑制率較高。考慮堿性蛋白酶的熱穩定性,本反應選用的最佳溫度為30 ℃。

2.1.3 反應時間對Plastein反應的影響

隨著反應時間的增加,Plastein反應修飾物的ACE抑制率和游離氨基酸的減少量都呈先上升后下降的趨勢。如圖1-c所示,ACE抑制率和游離氨基減少量都在反應3 h后達到最大。這是由于反應時間過短,反應不充分;反應時間過長后,可能會使ACE抑制肽分子質量增大,從而使ACE抑制活性降低。反應時間過長也會使一些氨基酸再次游離。UDENIGWE等[18]研究表明肽轉化這一可變步驟發生在反應0.5～3 h間。胡田媛等[9]的研究中,反應時間對修飾產物的ACE抑制率和游離氨基酸減少量的影響與本研究一致。因此,選擇3 h為最佳反應時間。

2.1.4 添加外源氨基酸對Plastein反應的影響

ACE抑制肽的結構會影響其活性。大量研究表明,在C端三肽序列處含有芳香族殘基(例如色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或脯氨酸)和N端位置含有支鏈脂肪族氨基酸(例如甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸),會導致多肽的ACE抑制活性升高和產生低的半抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)值[19-20]。

如圖2-a所示,隨著亮氨酸添加量的增加,反應產物的游離氨基酸減少量以及ACE抑制率呈現先上升后下降的趨勢,在亮氨酸添加量為0.5 mmol/g肽時,二者數值達到最大,分別為106.06 μmol/g和90.55%。圖2-b顯示,隨著甘氨酸添加量的增加,反應產物的游離氨基酸減少量和ACE抑制率都呈增加的趨勢,在甘氨酸添加量為0.7 mmol/g肽時達到最大,為84.63 μmol/g和88.07%。如圖2-c所示,苯丙氨酸添加量增加時,產物的ACE抑制率整體呈現上升趨勢,游離氨基酸減少量先增加后減少,當苯丙氨酸添加量為0.6 mmol/g肽時達到最大,為83.50 μmol/g,此時,反應產物的ACE抑制率為88.20%。XU等[21]添加苯丙氨酸對酪蛋白水解物進行Plastein反應修飾時,苯丙氨酸添加量為0.6 mol/mol酪蛋白水解物中游離氨基酸量,反應后水解物的降血壓活性增加。

a-亮氨酸;b-甘氨酸;c-苯丙氨酸圖2 外源氨基酸添加量對Plastein反應產物ACE抑制率和游離氨基酸含量的影響Fig.2 Effect of exogenous amino acids addition on ACE inhibitory rate and free amino acids content of Plastein reaction products

2.2 Plastein反應驗證實驗

分別以最優條件制備ACE抑制肽以及Plastein反應產物,并分別添加0.5 mmol/g肽亮氨酸、0.7 mmol/g肽甘氨酸以及0.6 mmol/g肽苯丙氨酸制備添加外源氨基酸的Plastein產物。質量濃度為1 mg/mL時測得各樣品的ACE抑制率如圖3所示。

圖3 不同類型產物的ACE抑制活性Fig.3 ACE inhibition activity of different types of products

經過Plastein反應修飾后的產物相較于未修飾的ACE抑制肽,除添加甘氨酸的Plastein反應產物外,其抑制活性都顯著增強(P<0.05)。其中,未添加外源氨基酸的Plastein反應產物的ACE抑制率最高,為90.67%。相較于未修飾的ACE抑制肽提高了3.62%。該結果與XU等[12]的類蛋白反應結果一致,其研究發現,當中性蛋白酶催化酪蛋白水解物進行類蛋白反應修飾后,修飾產物的ACE抑制活性提高,其IC50值從40.4 μg/mL降低至14.7 μg/mL。SUN等[22]通過Plastein反應對酪蛋白水解物修飾后,提高了水解物的ACE抑制活性,使其IC50值從52.6 μg/mL降低至14.9 μg/mL。

測定亮氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸的ACE抑制率以排除外源氨基酸自身具有ACE抑制活性的情況。其濃度與最優氨基酸添加量下Plastein反應產物中濃度相同,結果表明3種氨基酸均無ACE抑制活性,說明氨基酸是通過參與Plastein反應提高了ACE抑制肽的活性。

2.3 Plastein反應產物結構穩定性

圖4-a顯示,隨著NaCl溶液濃度增加,溶液濁度有所下降,但總體上沒有發生重大變化。該結果與DOUCET等[13]的研究結果一致,隨著NaCl溶液濃度由0.1 mol/L增加到2 mol/L,Plastein反應修飾后乳清多肽溶液的濁度也沒有明顯下降,結果表明能夠打破弱離子鍵的NaCl沒有導致聚集物的解離。因此,Plastein反應產物具有一定的離子穩定性。如圖4-b所示,Plastein反應產物在溫度<60 ℃時比較穩定,當溫度>60 ℃后,溶液濁度下降。可能是因為加熱破壞了Plastein反應產物中氫鍵的相互作用。這表明Plastein反應產物在60 ℃以下具有較高的穩定性。該結果與UDENIGWE等[6]的結果略有不同,其研究表明,酪蛋白的Plastein產物在100 ℃加熱后仍具有較好的穩定性,并且能夠保持抗氧化活性。

a-NaCl溶液;b-溫度;c-尿素;d-SDS圖4 不同環境條件對Plastein反應產物結構穩定性的影響Fig.4 Effect of different environment conditions on the structure stability of Plastein reaction products

如圖4-c所示,隨著尿素濃度升高,溶液濁度逐漸下降。尿素與蛋白質分子以氫鍵作用結合,引起蛋白質分子結構域的協同解折疊,會破壞蛋白質內部的氫鍵,使蛋白質增溶。JIANG等[14]研究了在尿素存在下Plastein反應修飾的海地瓜ACE抑制肽的穩定性,結果顯示尿素濃度對溶液的濁度值有顯著影響。Plastein反應產物在較低濃度的尿素溶液中具有穩定性。圖4-d顯示,隨著SDS濃度增加,溶液濁度下降。與UDENIGWE等[6]的研究結果一致。SDS因為同時存在親水基團和疏水基團,可以破壞分子間的疏水相互作用。溶液濁度下降表明高濃度的SDS破壞了Plastein反應產物的分子間疏水相互作用,使其溶解性增強。Plastein反應產物在低SDS濃度下具有較好的穩定性。穩定性實驗結果表明,離子鍵、氫鍵以及疏水相互作用使Plastein反應產物具有較好的結構穩定性,從而可以保持產物的ACE抑制活性。

2.4 圓二色譜分析

250 nm以下遠紫外區主要是蛋白質中肽鍵的吸收峰,可判斷蛋白質肽鏈的構象變化[23]。α-螺旋構象的特征是常在192 nm處為一正帶。β-折疊的特征性圓二色譜是在216 nm處有一負帶,在接近195 nm處,有一個相當大的正帶。如圖5所示,Plastein反應產物和未修飾的ACE抑制肽在190 nm都具有最大吸收峰,說明它們都含有α-螺旋,但不同的是Plastein反應產物在190 nm處的吸光值增強,且在215 nm附近的吸收峰發生紅移,說明Plastein反應促進了變性肽段重新扭曲折疊,導致溶液中α-螺旋和β-折疊的變化。該結果與LIU等[24]研究了Plastein反應后的乳清蛋白水解物,其松散的肽鏈會重新排列,形成有序的二級結構,主要由β-折疊組成。圓二色譜圖的變化說明Plastein反應中有新的二級結構生成,因此使ACE抑制肽的活性提高。

圖5 ACE抑制肽和Plastein反應產物的圓二色光譜Fig.5 CD spectra of ACE inhibitory peptide and Plastein reaction products

2.5 X-射線衍射分析

X-射線衍射技術是利用晶體形成的X-射線衍射,對物質進行內部原子在空間分布狀況的結構分析方法。每種晶體所產生的衍射花樣都反映出該晶體內部的原子分配規律。如圖6所示,Plastein反應產物的X-射線衍射圖譜與未修飾的ACE抑制肽相比,在22.1°的結晶峰強度變弱,這與JIANG等[14]測定的海地瓜酶解物的X-射線衍射圖譜類似,在其研究中,Plastein產物的XRD光譜在22.1°處的強吸收峰由高且尖銳變得弱而寬。31.7°和45.5°的結晶峰強度變強,更為顯著的是在56.4°、66.1°、75.3°和84.1°出現新的結晶峰。Plastein反應后原子沒有改變,但是原子的空間排布發生了變化,因此表明該反應改變了ACE抑制肽的結構,從而提高了ACE抑制肽的活性。

a-ACE抑制肽;b-Plastein修飾產物圖6 X-射線衍射圖譜Fig.6 X-ray diffraction patterns

3 結論

本研究利用Plastein反應對核桃ACE抑制肽進行修飾,探究了底物質量分數、反應溫度、反應時間以及添加外源氨基酸(亮氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸)對該反應的影響。經過Plastein反應修飾后,ACE抑制肽活性增強,未添加外源氨基酸的Plastein反應產物的ACE抑制率達到最高,為90.67%。探究了NaCl濃度、溫度和變性劑濃度對Plastein反應產物的影響,結果表明離子濃度為0～2 mol/L、溫度在60 ℃以下、變性劑濃度低于0.25 mol/L時Plastein反應產物具有較好的結構穩定性。圓二色光譜以及X-射線衍射圖譜研究結果表明,Plastein反應改變了ACE抑制肽的結構,從而提高了ACE抑制肽的活性。綜上所述,經Plastein反應修飾后的核桃ACE抑制肽的活性提高,并且具有較好的結構穩定性。