Na+調控乳清蛋白超濾效果研究

王文瓊,周吉陽,李健駒,黃冬成,郭勝,徐粉林,顧瑞霞*

1(揚州大學 食品科學與工程學院,江蘇乳品生物技術與安全控制重點實驗室,江蘇 揚州,225127)2(維維食品飲料股份有限公司,江蘇 徐州,221111)3(黑龍江大三源乳品機械有限公司,黑龍江 哈爾濱,150050)

在將不可逆污垢轉換為可逆污垢時,酸、堿、氧化劑、螯合劑和表面活性劑是常見的化學清潔劑[1]。但是它們引起的后續環境問題令人擔憂,化學品的消耗增加了膜系統的運行成本。研究顯示使用普通惰性鹽可以有效地去除污垢,這意味著鹽可以將污垢從不可逆狀態變為可逆狀態[2]。鹽清洗方法在離子交換清除有機污垢和凝膠層溶脹方面表現出很高的清洗效率。在所用的鹽中,NaCl是最有效的鈣橋有機污垢清潔劑[3]。XIANG等[4]研究了5種不同的一價鹽離子(即NaCl、KCl、CsCl、NaBr和NaI)和不同離子強度對牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)對膜污染的影響。結果發現在Na+的存在下, BSA的過濾性能有明顯改善,并且增加鹽濃度可促進BSA的過濾效率,降低蛋白的不可逆污染,緩解膜污染,并增加了靜電排斥力。乳清蛋白超濾過程中引起的膜污染需要不同的鹽濃度才能有效清潔。蛋白表面疏水性官能團的暴露及二級結構的展開都與膜污染的程度相關[5],乳清蛋白在超濾的過程中,溶液中離子濃度不斷變化,與蛋白結構的變化有著密切的關系,蛋白結構的不斷變化導致蛋白與蛋白、蛋白與膜之間相互作用的變化,當蛋白的疏水結構暴露,蛋白在膜表面的污染加劇,隨著超濾時間的延長,由可逆污染變為不可逆污染,膜通量下降,此時需要進行化學膜清洗,恢復膜通量[6]。

由于超濾過程中,截留液中的Na+濃度不斷變化,然而關于不同的Na+濃度下,乳清蛋白表面結構的變化及與膜污染之間的關系研究較少。本文選擇在不同超濾時間點加入Na+,通過膜通量監測及膜表面蛋白含量的測定,確定可以延緩膜污染的最佳Na+調控時間和濃度條件。通過拉曼光譜、紅外光譜和圓二色譜考察Na+調控條件對乳清蛋白超濾過程中截留液蛋白和膜表面蛋白結構的影響,探索離子調控蛋白結構變化與膜污染之間的關系,揭示Na+調控對乳清蛋白超濾效果的影響機制,為進一步調控離子比例,提高膜過濾效率,減輕膜污染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑及設備

聚醚砜膜(polyethersulfone, PES), 美國納諾斯通水務公司,截留分子質量為10 kDa;NaCl,天津科密歐化學試劑有限公司;所有溶液均以去離子水配制。

J-600圓二色譜儀,日本JASCO公司;670-IR+610-IR紅外光譜儀,美國Varian公司; inVia拉曼光譜儀,英國Renishaw公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膜通量的測定

采用不同濃度的NaCl溶液調節乳清蛋白超濾過程中截留液的離子強度,選擇在0、4、8 min分別加入不同濃度(5、10、15、20 mmol/L)的NaCl溶液進行調控,監測超濾24 min時的膜通量變化,以未經離子調控的超濾24 min的乳清蛋白樣品為對照組,進行對比。采用死端過濾,跨膜壓力0.3 MPa。膜通量的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:V,不同超濾時間的滲透體積,mL;A,膜表面積,cm2;Δt,2次質量測量之間的時間,min[7]。

1.2.2 蛋白濃度的測定

對Na+調控后的超濾膜表面乳清蛋白含量進行測定。

采用Lowry法測定蛋白含量[8]:1 mL 10 g/L的CuSO4·5H2O,1 mL 20 g/L的酒石酸鉀鈉和100 mL 20 g/L的Na2CO3試劑混合備用;將標準蛋白,BSA溶解于1 mol/L NaOH,配制成1 mg/mL的BSA溶液;取0.5 mL不同濃度的蛋白溶液,放至10 mL離心管中;向不同濃度的BSA溶液中加入5 mL上述混合液,攪拌10 min;加入0.5 mL 1 mol/L福林酚試劑,反應30 min,660 nm處測定吸光值,繪制標準曲線。

1.2.3 二級結構的測定

在25 ℃下,使用圓二色譜儀測定修飾蛋白質的二級結構,光譜分辨率為0.5 nm。光譜(190～250 nm)使用10 mm路徑長度的石英電池記錄,掃描速度為100 nm/min,靈敏度為20 mdeg。將樣品稀釋至0.2 mg/mL。校正圓二色譜中溶劑的貢獻,并用特定橢圓度和波長表示。使用Jasco SSE-338蛋白質二級結構分析程序進行二級結構組成的評估[9]。

1.2.4 Na+調控過程中超濾膜表面蛋白結構的測定

拉曼光譜:將膜表面蛋白分散在重水中至100 mg/mL溶液中,5 ℃下儲存48 h,以在分析前進行完全H/D交換。實驗條件是掃描頻率范圍200～1 800 cm-1,He-Ne激光器,波長632.8 nm,功率6.4 mW,積分時間100 s,室溫[10]。

紅外吸收光譜:采用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法(attenuated total refraction Fourier transform infrared spectrometry, ATR-FTIR)分析,入射角45°使用32掃描/光譜分辨率1 928 cm-1[11]。

1.2.5 膜阻力的測定

對Na+調控后的超濾膜進行膜阻力的測定,膜通量的計算根據Darcy公式,如公式(2)和公式(3)所示[12]:

(2)

Rt=Rm+Rc+Rp

(3)

式中:J,膜通量,mL/(cm2·min);ΔP,乳清過濾時膜兩側壓力差,kPa;μ,進料液黏度,Pa·s;Rt,乳清膜過濾總阻力,cm-1;Rm,聚醚砜膜自身阻力,cm-1;Rc,乳清蛋白膜餅層阻力,cm-1;Rp,乳清蛋白膜孔堵塞阻力,cm-1。

1.3 數據分析

每個實驗重復3次,結果表示為平均值±偏差。數據統計分析采用SPSS 11.5軟件(P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著),圖1和圖2將所有數據放在一起進行顯著性分析,圖3和圖4顯著性分析采用組內比較,相同字母表示差異不顯著,不同字母表示差異顯著,采用Origin 8.5繪圖。

圖2 不同超濾時間和不同濃度Na+調控后膜表面蛋白含量Fig.2 Membrane surface protein content regulated by various Na+ concentrations at different ultrafiltration times

圖3 不同超濾時間和不同濃度Na+調控后膜阻力分析Fig.3 Membrane resistance treated with different concentration of Na+ at different ultrafiltration times

a-超濾膜表面蛋白;b-截流液蛋白圖4 不同超濾時間和不同濃度Na+調控后蛋白二級結構Fig.4 Secondary structure of protein regulated by different concentration of Na+ at different ultrafiltration times

2 結果與分析

2.1 Na+調控對乳清蛋白超濾過程中膜通量的影響

在超濾時間0、4、8 min時分別加入5、10、15、20 mmol/L NaCl,觀察24 min時膜通量變化,與未加入Na+調控的乳清超濾效果比較。由圖1可知,在超濾0 min時,加入Na+濃度為5～10 mmol/L時,膜通量升高,主要是由于Na+的加入,產生了鹽溶效應,Na+降低了蛋白表面電荷引力,降低了蛋白與蛋白之間的電荷引力聚集的情況,使得膜通量升高[4]。在超濾4 min時加入Na+濃度為15 mmol/L膜通量增加,加入5、10、20 mmol/L NaCl均使膜通量降低。在超濾8 min時,加入10 mmol/L NaCl超濾效果最好。研究表明,在相對較高的離子強度下,膜污染減輕主要是由于水合排斥力的增加[13]。但離子強度過高會產生鹽析現象,蛋白聚集沉淀。Na+濃度增加到15 mmol/L時,通量降低,繼續增加到20 mmol/L時,膜通量變化不顯著,與靜電屏蔽效應有關,此時更多Na+吸附在膜表面,引起了更高的電荷屏蔽效應,使蛋白間的繼續聚集沉淀現象減弱,因此Na+濃度的繼續增加降低了蛋白與蛋白、蛋白與膜之間的相互作用[14]。因此,在超濾開始時(0 min),加入10 mmol/L Na+可以有效提高乳清蛋白超濾膜通量。

2.2 Na+調控對超濾過程中膜表面蛋白含量的影響

由圖2可知,在不同時間點加入不同濃度的Na+,膜表面蛋白含量變化顯著。在超濾時間4、8 min時加入5 mmol/L Na+進行調控時,膜表面蛋白含量與對照組相比,膜表面蛋白含量變化不顯著,主要是Na+濃度較小,對膜表面蛋白含量影響較小。在超濾4 min時,加入20 mmol/L Na+時膜表面蛋白含量增加高于對照組,在超濾8 min時加入20 mmol/L Na+時,膜表面蛋白含量顯著升高,高于對照組,主要是離子強度的增加,引起靜電荷屏蔽效應和電荷中和效應,乳清蛋白超濾環境中的負電荷隨著Na+濃度的增加而降低,蛋白內部和分子間排斥力減弱,促進聚合物折疊[15],蛋白堆積在膜表面或沉積在膜孔中,膜表面蛋白含量增高。

在超濾0 min時加入10 mmol/L Na+時蛋白含量最低,此時通量增加,超濾效果較好,膜表面蛋白含量較低,主要是水合Na+的存在,在帶負電的蛋白周圍形成了一個特殊的水合層,水合排斥力增加[16]。隨著Na+濃度的增加,蛋白在膜表面的堆積增加,與乳清溶液中多種離子的比例失衡導致蛋白疏水結構的暴露有關。在超濾4 min時,加入15 mmol/L Na+調控時,超濾24 min時監測膜表面蛋白含量減少。超濾8 min時,加入10 mmol/L Na+調控,超濾24 min時膜表面蛋白含量最低,說明在超濾前8 min時,沉積在膜表面的蛋白在Na+加入后,出現了鹽溶現象,部分蛋白從膜表面進入截留液中,超濾到24 min時膜表面蛋白含量顯著低于對照組,膜污染減輕。在超濾8 min時,加入15 mmol/L Na+,膜表面蛋白含量相較于對照組無明顯變化,過濾效果較差。隨著離子強度的增加到20 mmol/L,由于雙電層的壓縮,邊界層較高的離子濃度會導致乳清蛋白液體的電荷中性破壞[17],膜表面積累的Na+使蛋白發生鹽析,多孔性蛋白質沉積在膜表面,使滲透性降低。隨著過濾的進行,蛋白質不斷沉積在濾餅層上,形成餅層阻力,膜通量下降[18]。

2.3 Na+調控對超濾過程中膜阻力的影響

以上研究發現,在超濾0、4、8 min時,分別加入10、15、10 mmol/L的Na+調控,與對照組相比可以有效的提高膜通量,24 min后膜表面蛋白的沉積量降低,因此選取以上調控條件的樣品,分別監測離子調控后的乳清蛋白超濾24 min時的膜阻力。如圖3所示,與對照組相比,Na+調控后,膜總阻力均有下降,其中在超濾0 min加入10 mmol/L NaCl調控后,超濾24 min時刻,與對照組相比膜總阻力最低,通量最高。Na+可降低膜污染中的孔隙堵塞,從圖3可以看出,在超濾4 min和8 min時進行Na+調控后的乳清蛋白阻力均有顯著下降,同時與對照組相比,餅層阻力也均有降低[19]。主要是Na+含量升高,靜電屏蔽效應減弱,膜表面蛋白沉積減少,餅層阻力下降。在超濾0 min時,加入10 mmol/L NaCl的膜表面蛋白濃度較低,說明此時加入該濃度的Na+可以有效降低餅層阻力。在超濾8 min時,加入10 mmol/L時和4 min加入15 mmol/L Na+時,膜總阻力相較于0 min調控較高,但阻力較低,由前文中研究可以發現7 min時發生孔隙堵塞,說明在該時間點前或臨近該時間點加入Na+調控有助于減輕孔隙堵塞的形成,提高過濾效率。

2.4 Na+調控對超濾過程中膜表面蛋白二級結構的影響

以上研究發現,在超濾0、4、8 min時,分別加入10、15、10 mmol/L時的Na+調控與對照組相比可以有效地提高膜通量,降低24 min后膜表面蛋白的沉積量,因此選取以上調控條件的樣品,分別取超濾24 min時,截留液和膜表面蛋白進行表面結構分析,考察Na+調控對蛋白二級結構和表面基團的影響,分析其調控機制。由圖4可知,在超濾0 min時,加入10 mmol/L Na+進行調控時,α-螺旋含量上升,β-折疊含量降低,β-轉角以及無規則卷曲含量上升。β-折疊結構對于蛋白空間網狀結構的形成具一定的作用,常見于折疊區域,但其結構不穩定,蛋白結構易發生變化,形成聚集體,在聚集體狀態下,β-折疊易于轉向β-轉角及無規則卷曲。因此,在超濾0 min時,加入10 mmol/L Na+使蛋白質β-折疊含量降低,降低了蛋白在膜表面的聚集沉淀,提高了膜通量,與圖1和圖2得到的結論一致。

在超濾4 min時,加入15 mmol/L的Na+進行調控時,α-螺旋和β-折疊含量降低,β-轉角以及無規則卷曲含量上升。氫鍵被破壞,β-折疊和β-轉角含量的增加能夠改變蛋白質-蛋白質之間的相互作用,促進蛋白質在膜表面形成疏松餅層,減輕膜污染,但與在超濾0 min時,加入10 mmol/L Na+比較,膜污染增加。在超濾8 min時,加入10 mmol/L時,α-螺旋含量與對照組相比無明顯變化,β-折疊含量降低,β-轉角以及無規則卷曲含量上升。在超濾8 min加入時Na+調控,相較于在超濾0 min時加入,膜污染減緩效果較弱,此時通量上升可能是由于蛋白質與蛋白質之間的吸引力導致蛋白質結構不穩定,發生β-折疊向β-轉角和無規則卷曲轉變。而且,截留液中的乳清蛋白的α-螺旋含量高于膜表面蛋白,無規則卷曲的含量也低于膜表面蛋白,因此,在超濾的初始階段加入一定量的Na+調控,有助于乳清蛋白β-折疊以及無規則卷曲含量降低,促進更多的蛋白離開膜表面,進入截留液中,有利于緩解膜污染。

2.5 Na+調控對超濾過程中膜表面蛋白結構的影響

2.5.1 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)表征

Na+濃度與蛋白在溶液中的結構,表面基團的暴露有關,而乳清蛋白在超濾濃縮的過程中,蛋白表面親疏水基團的暴露與超濾過程中蛋白在膜表面的聚集和不可逆膜污染的形成有關。通過FTIR和拉曼光譜探索Na+有效調控乳清蛋白超過濾機制。截流液蛋白紅外光譜圖與對照組相比(圖5-b),Na+調控后3 500～3 300 cm-1親水基團O—H吸收峰減弱,膜表面蛋白在3 500～3 300 cm-1親水基團O—H吸收峰與之相反,羥基的伸縮振動加強,說明膜表面蛋白分子間氫鍵和分子內氫鍵作用力增加。

a-膜表面蛋白;b-截流液蛋白圖5 不同超濾時間和不同濃度Na+調控后膜表面蛋白和截留液蛋白紅外光譜Fig.5 Infrared spectra of membrane surface proteins and retention protein regulated by different concentration of Na+ at different ultrafiltration times

2.5.2 拉曼光譜表征

a-膜表面蛋白;b-截流液蛋白圖6 不同時間和不同濃度Na+調控后膜表面蛋白和截流液蛋白拉曼光譜Fig.6 Raman spectra of membrane surface proteins and retention proteins regulated by Na+ at different times and concentrations

3 結論