K+誘導(dǎo)豆腐柴果膠凝膠化

賀超,尹樂斌*,何攀,鄒文廣,劉聰,龍盼,李敏娟

1(邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院,湖南 邵陽,422000)2(中南糧油食品科學(xué)研究院有限公司,湖南 長沙,410000)

果膠廣泛分布于高等植物的初生細(xì)胞壁和細(xì)胞間區(qū)域,由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯組成[1]。天然果膠類物質(zhì)以原果膠、果膠、果膠酸的形態(tài)廣泛存在于植物的果實、根、莖和葉中,是細(xì)胞壁的一種組成成分,它們伴隨纖維素而存在,構(gòu)成相鄰細(xì)胞中間層黏結(jié)物,使植物細(xì)胞緊緊黏結(jié)在一起[2]。根據(jù)酯化程度,果膠可分為高甲氧基果膠(high methoxyl pectin,HMP)[酯化度(degree of esterification,DE)>50%]和低甲氧基果膠(low methoxyl pectin,LMP) (DE<50%)[3]。HMP凝膠在低pH和高糖濃度下形成,由于在低pH值下可以防止羧基的解離,高度水解和帶電荷的羧基被轉(zhuǎn)化為不帶電荷的羧基分子,分子間的斥力減小,分子的水合作用減弱,促進(jìn)了分子間結(jié)合和三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[4]。糖和酸并不是LMP凝膠化的必要條件,二價陽離子如Ca2+通常用于誘導(dǎo)其凝膠化,當(dāng)二價陽離子加入LMP溶液時,Ca2+和果膠鏈上游離的羧基之間被描述為“蛋箱”模型的交聯(lián)相互作用[5]。通常,單價陽離子不會引起果膠的膠凝,在堿性pH下向HMP中加入單價陽離子會導(dǎo)致HMP的膠凝,這取決于單價陽離子和果膠的濃度[6]。CHEN等[7]在AOP 中加入單價陽離子導(dǎo)致了 AOP 的凝膠化,隨著單價陽離子和果膠濃度的增加,果膠凝膠的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變得更加致密,凝膠強(qiáng)度增加,單價陽離子和游離羧基之間的屏蔽和靜電吸引可能主導(dǎo)HMP的凝膠化[8]。

神仙豆腐是從豆腐柴中提取果膠凝膠后形成的產(chǎn)品,含有豐富的果膠、蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、異黃酮、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分,具有極高的營養(yǎng)價值,是最具開發(fā)和食用潛力的營養(yǎng)食品之一[9]。其主要原料豆腐柴(PremnamicrophyllaTurcz),又名豆腐木、豆腐葉、臭黃荊、觀音桔、土黃芪、腐婢等,為馬鞭草科豆腐柴屬多年生落葉灌木,營養(yǎng)成分豐富,富含果膠和蛋白質(zhì),是一種新型的食藥兩用型植物,主要分布于我國的陜西南部、云南、四川、貴州、浙江、湖北、湖南等地。用草酸銨從豆腐柴中提取出的果膠 AOP 是一種富含低酯化度(DE:14.26%)和高半乳糖醛酸LMP,該特性有助于果膠發(fā)揮良好的膠凝性能。

本文研究了K+誘導(dǎo)AOP凝膠化,通過動態(tài)流變測試、硬度測試、保水性(water holding capacity,WHC)測試、X射線衍射光譜(X-ray diffraction,XRD)測試、微觀結(jié)構(gòu)觀察、傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared,FT-IR)測試和凝膠作用力進(jìn)一步探討了K+對AOP凝膠的影響。研究結(jié)果可為一價陽離子誘導(dǎo)果膠凝膠化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆腐柴葉粉,嵐皋縣綠竹食品有限公司;KCl,天津化學(xué)試劑有限公司;尿素,廣州賽國生物科技有限公司;十二烷基硫酸鉀(potassium lauryl sulfate,PDS),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;95%乙醇,巴斯夫生物科技有限公司;蒸餾水,邵陽學(xué)院實驗室提供;NaOH,上海巨鵬化工有限公司;半乳糖醛酸(98%),源葉生物有限公司;濃H2SO4,成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Haake RheoStress 6000流變儀、Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀、ST-16R高速冷凍離心機(jī),Thermo Fisher Scientific公司;W201B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海申勝生物技術(shù)有限公司;FD-1A-50冷凍干燥機(jī),北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;TA-XT Plus物性測試儀,英國Stable Micro Systems有限公司;D/MAX2500V X射線衍射儀,日本理學(xué)株式會社;Gemini 500掃描電子顯微鏡,德國卡爾蔡司公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 豆腐柴果膠(AOP)凝膠的制備

根據(jù)PAN等[10]的方法,用草酸銨提取法提取AOP。首先,采用索氏提取法對新鮮豆腐柴粉末進(jìn)行去色素、去脂肪處理。之后,粉末與95%體積分?jǐn)?shù)乙醇按照料液比1∶30(g∶mL)進(jìn)行混合,將懸浮液置于冰箱(4 ℃)中保存24 h,過濾后得到不溶性固體。將0.1 mol/L的草酸銨溶液加入不溶性固形物中[按料液比1∶30(g∶mL)],70 ℃加熱30 min。離心后(11 000 r/min,10 min,25 ℃),將上清液加入95%乙醇中(上清液與乙醇以1∶30 體積比混合),4 ℃保存24 h。隨后,收集固體,干燥后用超純水透析(48 h,分子截留量14 kDa)。透析液凍干過夜獲得AOP。另外,配制1 mol/L的KCl溶液。將AOP儲備液與KCl溶液按不同比例混合于10 mL體系的離心管中,來制備混合物(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L, K+體積分?jǐn)?shù)為0.3% AOP),室溫靜置12 h后觀察其狀態(tài),拍攝獲得直觀圖。

1.3.2 動態(tài)流變學(xué)測試

根據(jù)1.3.1節(jié)的方法制備了含不同K+濃度(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L)的AOP凝膠。用流變儀在振蕩模式下對凝膠進(jìn)行頻率掃描測量,從而獲得果膠凝膠的儲能模量(G′)和損耗角(tanδ=G″/G′)與振蕩頻率之間的變化關(guān)系。實驗參數(shù)設(shè)置為:平行板夾具(直徑35 mm,間隙1 mm),恒溫25 ℃,剪切應(yīng)力0.1 Pa,頻率0.1～10 Hz。

1.3.3 凝膠硬度測試

在測試凝膠硬度之前,將含有不同K+濃度的AOP凝膠(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L),根據(jù)1.3.1節(jié)的方法在20 mL的玻璃樣品瓶(φ=27.5 mm,h=57.0 mm)中制備,使得凝膠高度約為10.0 mm。測試過程中,使用P/0.5圓柱形探頭進(jìn)行硬度測試,允許以1.0 mm/s的速度壓縮凝膠至4.0 mm深度,施加5 g的觸發(fā)力[11]。每個凝膠制備3個樣本,每個樣本測試1次。

1.3.4 WHC測試

含不同K+濃度(0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L)的AOP凝膠WHC根據(jù)LI等[12]的方法測定。離心前稱取AOP凝膠的質(zhì)量,稱取質(zhì)量記為mt,離心后(10 000 r/min,10 min,25 ℃),稱量離心水,其質(zhì)量記為mr。凝膠的WHC按公式(1)計算:

(1)

1.3.5 XRD測試

將AOP和冷凍干燥后的凝膠樣品置于XRD儀中分析,測試條件為:CuKα靶,掃描范圍2θ為5～60°,掃描速率2°/min。

1.3.6 掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)測試

根據(jù)SONG等[13]的方法,采用SEM觀察凝膠微觀結(jié)構(gòu)。按照1.3.1節(jié)的方法制備了不同K+濃度誘導(dǎo)的AOP凝膠后,再轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中冷藏12 h后,冷凍干燥12 h。將凍干后的凝膠噴金后,置于掃描電子顯微鏡中觀察,加速電壓為5.0 kV。在1 000倍下觀察每個樣品的顯微照片。采用XT Microscope Control軟件釆集圖譜。

1.3.7 FT-IR測試

稱取冷凍干燥后的AOP和AOP凝膠樣品1～3 mg進(jìn)行KBr壓片,然后放入樣品池中,采用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行掃描檢測,光譜范圍4 000～400 cm-1,分辨率4 cm-1。

1.3.8 凝膠作用力測試

通過硬度測試和動態(tài)流變學(xué)測試,分析AOP與K+之間的凝膠作用力。將10 mol/L尿素、2%(體積分?jǐn)?shù))PDS兩種不同的解離試劑分別在AOP-K+凝膠配制的過程中加入。室溫靜置12 h后,流變學(xué)測量按1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)中的方法進(jìn)行。

1.4 處理及分析

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。采用Origin 8.0軟件繪制圖表,利用LSD測試和SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)。P<0.05表示為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 AOP凝膠的可視化觀察和動態(tài)流變學(xué)研究

圖1展示了添加不同濃度的K+后,0.3%(體積分?jǐn)?shù))AOP溶液狀態(tài)的變化。在AOP溶液中,K+濃度為0.3 mol/L時發(fā)生聚集,但形成的聚集物掉入到了管底(圖1-b)。因此,此時AOP沒有形成堅固的凝膠。當(dāng)K+濃度>0.4 mol/L時,AOP形成了堅固的凝膠。動態(tài)流變試驗常用來表征凝膠的形成,損耗因子tanδ可作為評估標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)樣品的tanδ>1時,通常認(rèn)為是液體;當(dāng)試樣的tanδ<1時,一般認(rèn)為它具有固體性質(zhì)。tanδ值越小,說明凝膠的固體性質(zhì)越高。

a-正立圖;b-倒立圖圖1 不同K+濃度下AOP凝膠圖Fig.1 Diagrams of AOP gel at different K+ concentration

如圖2所示,含0.3 mol/L K+時AOP的G′顯著低于其他樣品。另外,其tanδ≈0.7,高于其他凝膠。表明AOP在0.3 mol/L處形成的聚集體結(jié)構(gòu)最弱。隨著K+濃度的增加,樣品的G′增大,在0.6 mol/L時達(dá)到最大值,同時,tanδ達(dá)到最低值,低于0.1。這表明,0.6 mol/L K+對AOP的凝膠化最有利,在此濃度下可以形成具有最高類固體性質(zhì)的凝膠。K+誘導(dǎo)的AOP凝膠化可能歸因于K+的靜電屏蔽效應(yīng),這可能導(dǎo)致AOP鏈形成更多纏結(jié),果膠鏈之間可能形成更多低鍵能相互作用,如氫鍵[14-15]。

a-G′;b-tanδ圖2 含不同K+濃度的AOP凝膠的G′和tanδFig.2 G′ and tanδ of the AOP gel with different K+ concentrations

2.2 凝膠硬度和WHC分析

如圖3所示,通過差異性分析,可以得到不同K+濃度對承壓力和WHC存在顯著差異性(P<0.001,t=7.356)、(P=0.001,t=6.847)。隨著K+濃度的增加,從0.4到0.6 mol/L凝膠硬度增加,在0.7 mol/L時下降,而AOP凝膠的WHC也有類似的變化趨勢(圖3)。AOP凝膠的最高WHC也出現(xiàn)在0.6 mol/L,這些結(jié)果與可視圖一致。由此可知,存在一個最佳的K+濃度,使得AOP凝膠的凝膠硬度和WHC最強(qiáng)。陳曄等[16]研究了單價陽離子對柑橘果膠凝膠硬度和WHC的影響,結(jié)果表明,存在一個最佳的K+濃度(0.8 mol/L)使得柑橘果膠形成具有最佳的凝膠硬度和WHC的凝膠。隨著K+的加入,果膠鏈之間的斥力減小使得果膠鏈之間的距離減小,為氫鍵提供了更多的結(jié)合區(qū)域,從而增強(qiáng)了凝膠結(jié)構(gòu),提高了凝膠硬度。同時,當(dāng)形成更多的氫鍵時,更多的水會在凝膠網(wǎng)絡(luò)中纏結(jié),增加了AOP凝膠的WHC。然而,由于維持凝膠結(jié)構(gòu)需要足夠的靜電斥力,當(dāng)K+濃度高于最佳濃度時,果膠鏈間斥力的進(jìn)一步降低可能會降低凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此,AOP凝膠的硬度和WHC會降低。

a-凝膠硬度;b-保水性圖3 含不同K+濃度的AOP果膠的凝膠硬度和保水性Fig.3 Gel hardness and water holding capacity of AOP pectin with varying K+ concentrations

2.3 XRD分析

如圖4所示,K+的加入對AOP的晶型結(jié)構(gòu)有顯著的影響。從AOP的XRD圖譜(圖4-a)可以看出,有寬吸收峰,說明AOP具有非晶型結(jié)構(gòu)。在所有的AOP凝膠中(圖4-b),AOP的2個特征峰消失了,又形成了新的峰,說明K+的加入會導(dǎo)致AOP形成新的晶體結(jié)構(gòu)。此外,含有0.6 mol/L K+的凝膠具有最強(qiáng)的峰強(qiáng)度,而峰強(qiáng)度在0.7 mol/L處降低。這意味著在0.6 mol/L K+形成的凝膠比在0.7 mol/L K+形成的凝膠具有更有序的結(jié)構(gòu)。董姬秀等[17]研究了K+濃度對涼粉單多糖-大豆分離蛋白復(fù)合凝膠的影響。他們發(fā)現(xiàn),當(dāng)K+含量較高時,復(fù)合凝膠的原始特征峰幾乎消失,并形成新的尖銳特征峰,這意味著會產(chǎn)生新的分子間相互作用。新晶體結(jié)構(gòu)的形成可能是由于K+的靜電屏蔽作用,導(dǎo)致了AOP鏈的纏結(jié)。隨后,果膠鏈上未解離的羧基產(chǎn)生了更多的氫鍵,AOP發(fā)生了凝膠化。在這個過程中,可能會形成一個更有序的結(jié)構(gòu)。但當(dāng)K+的含量高于最佳濃度時,凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定下降,從而降低了AOP凝膠的規(guī)律性。

a-AOP;b-AOP凝膠圖4 AOP和在不同K+濃度下AOP凝膠的XRD圖Fig.4 XRD plot of AOP and AOP gel at different K+ concentrations

2.4 SEM分析

如圖5-a所示,在K+含量為0.4 mol/L時,AOP凝膠呈現(xiàn)出了較為疏松、多孔的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),凝膠網(wǎng)絡(luò)中的空隙較大。而隨著K+濃度增加到0.6 mol/L(圖5-c),AOP凝膠呈現(xiàn)出了更加致密、均勻、光滑的微觀結(jié)構(gòu),凝膠網(wǎng)絡(luò)中的空隙越來越小,說明鹽離子的增加,強(qiáng)化了AOP凝膠的結(jié)構(gòu)。此外,隨著K+濃度的增加,凝膠表面出現(xiàn)的塊狀物質(zhì)也隨著增多,當(dāng)鹽離子濃度達(dá)到0.7 mol/L時,凝膠表面出現(xiàn)了大量的塊狀顆粒,這可能是由于AOP在較高濃度K+的誘導(dǎo)下,發(fā)生了較強(qiáng)的凝聚作用,從而隨機(jī)形成了大量不規(guī)則的聚集體。這種作用可能弱化了AOP凝膠的強(qiáng)度。

a-0.4 mol/L;b-0.5 mol/L;c-0.6 mol/L;d-0.7 mol/L圖5 在不同K+濃度下AOP凝膠的SEM圖Fig.5 SEM plots of the AOP gels at different K+ concentrations

2.5 FT-IR分析

a-AOP;b-AOP凝膠圖6 AOP和在不同K+濃度下AOP凝膠的FT-IR圖譜Fig.6 FT-IR profile of AOP and AOP gel at different K+ concentrations

2.6 凝膠作用力分析

在AOP凝膠的制備中加入尿素和PDS 2種解離劑,分別破壞氫鍵、疏水相互作用。制備的凝膠用于動態(tài)流變試驗。結(jié)果表明,尿素對AOP凝膠的影響最顯著(圖7),與對照組相比,含有尿素的樣品的G′明顯降低。同時,其tanδ明顯高于其他樣本,表明此樣品的類固體性質(zhì)被大大削弱。含有PDS的凝膠樣品,其G′和tanδ沒有顯著的不同的控制。這些結(jié)果證實了氫鍵在AOP凝膠化過程中起著最重要的作用,而疏水鍵的作用很小。ZHOU等[20]研究了低甲氧基果膠的酸誘導(dǎo)凝膠化,他們發(fā)現(xiàn),分子之間的氫鍵會促進(jìn)低甲氧基果膠在酸性pH下(2.5)的凝膠化。由于AOP的酯化度很低,果膠上并沒有很多疏水區(qū)域。因此,果膠鏈之間的疏水相互作用受到很大限制。相反,AOP含有高含量的聚半乳糖醛酸,所以羧基廣泛分布在果膠鏈上。因此,當(dāng)靜電斥力在AOP鏈之間減弱時,相鄰的未解離的羧基之間往往形成氫鍵,主導(dǎo)著AOP的凝膠化。因此,氫鍵可能是AOP凝膠化的主要作用力。

a-G′;b-tanδ圖7 包含不同的解離試劑(2 mol/L尿素和體積分?jǐn)?shù)為0.4%PDS)的0.6 mol/L K+的AOP凝膠的G′和tanδFig.7 G′ and tanδ of a 0.6 mol/L K+ AOP gel containing different dissociation reagents (2 mol/L urea and 0.4% PDS)

2.7 凝膠機(jī)理分析

根據(jù)HUANG等[21]的研究,在常溫下鹽離子與pH對果膠的凝膠化起到了主導(dǎo)作用。鹽離子種類的不同會導(dǎo)致果膠形成凝膠的機(jī)理不同。一般來說,二價陽離子加入到低酯果膠中時,能夠通過結(jié)合解離的羧酸根基團(tuán),在相互靠近的果膠分子鏈的光滑區(qū)之間形成分子間的離子結(jié)合點[22]。另外,從構(gòu)成凝膠的分形聚集體(絮凝體)的微觀動力學(xué)角度來說,當(dāng)Ca2+濃度在臨界鹽濃度以上,絮凝體間通過相互連接形成反應(yīng)受限的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),因此Ca2+介導(dǎo)的果膠凝膠使絮凝體間的交聯(lián)強(qiáng)于絮凝體內(nèi)的交聯(lián),使得凝膠處于“強(qiáng)交聯(lián)”狀態(tài)[23]。對于單價陽離子,K+誘導(dǎo)果膠形成凝膠的機(jī)理與二價陽離子不同,在高酯果膠進(jìn)行去酯化的過程中,一定濃度的單價鹽離子的存在會使得果膠分子上解離的羧酸根基團(tuán)會與單價陽離子結(jié)合,降低了靜電斥力,使得果膠的擴(kuò)展度降低,之后K+會與羥基形成一定的靜電吸引作用,從而形成凝膠[24]。另外,有研究指出,對于低酯果膠,在較低pH下(2～4),一價離子的存在進(jìn)一步降低了低酯果膠鏈間的電荷排斥,并通過氫鍵的作用形成凝膠[25-26]。pH的變化會導(dǎo)致果膠分子鏈的構(gòu)象、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,在較高pH下,果膠鏈的構(gòu)象是高度伸展的,其局部幾何結(jié)構(gòu)接近于二級有序結(jié)構(gòu),而隨著pH的降低,果膠的鏈構(gòu)象將轉(zhuǎn)換成可逆的更加緊實的三維結(jié)構(gòu)。當(dāng)pH達(dá)到果膠鏈幾乎不帶電的非常低的pH值時,果膠鏈會通過三倍螺旋的二聚作用形成凝膠[27]。在這個過程中,羧基基團(tuán)會通過形成氫鍵來穩(wěn)定凝膠結(jié)構(gòu)。

基于上述討論和實驗結(jié)果,可以推斷出K+誘導(dǎo)AOP凝膠化的機(jī)理(圖8)。在AOP溶液中加入KCl溶液時,K+會與果膠鏈上游離的羧基結(jié)合,產(chǎn)生靜電屏蔽效應(yīng),從而降低了AOP分子內(nèi)部和分子間的靜電斥力,降低了AOP的膨脹程度,使果膠分子相互靠近。同時,AOP分子內(nèi)和分子間的氫鍵將通過果膠鏈上的羥基和未解離的羧基形成,從而導(dǎo)致果膠分子間的結(jié)合和凝膠的形成。此外,有一個最佳的K+濃度有助于AOP凝膠的最佳結(jié)構(gòu)。當(dāng)K+含量超過最佳濃度時,果膠分子間的靜電斥力將大大降低,AOP分子間的結(jié)合將更加強(qiáng)烈。在此過程中,果膠分子隨機(jī)聚集,大大降低了凝膠結(jié)構(gòu)的有序性和強(qiáng)度。

圖8 K+誘導(dǎo)豆腐柴果膠自凝膠Fig.8 K+ induced P.microphylla pectin self-gel

3 結(jié)論

本研究對K+誘導(dǎo)AOP凝膠化進(jìn)行了研究,證明了K+濃度對AOP凝膠的形成有決定性的影響。此外,K+誘導(dǎo)AOP凝膠化主要是由靜電屏蔽和氫鍵引起的,0.6 mol/L的K+濃度是AOP形成固體狀特征和穩(wěn)定結(jié)構(gòu)凝膠的最佳濃度,在AOP溶液中加入KCl溶液時,K+會與果膠鏈上游離的羧基結(jié)合,產(chǎn)生靜電屏蔽效應(yīng),從而降低了AOP分子內(nèi)部和分子間的靜電斥力,降低了AOP的膨脹程度,使果膠分子相互靠近。同時,AOP分子內(nèi)和分子間的氫鍵將通過果膠鏈上的羥基和未解離的羧基形成,從而導(dǎo)致果膠分子間的結(jié)合和凝膠的形成。當(dāng)K+濃度高于最適濃度時,果膠分子強(qiáng)烈聚集導(dǎo)致了凝膠強(qiáng)度和穩(wěn)定性的降低,使得其凝膠性能降低。