三種形態(tài)藍(lán)靛果花色苷的提取工藝及其抗氧化活性研究

劉英,秦程玉,吳嘉儀,周文玲,李德文*

1(東北林業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工與資源利用學(xué)院,黑龍江 哈爾濱,150040)2(東北林業(yè)大學(xué),森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱,150040)

藍(lán)靛果(LoniciceracaeruleaL.)是忍冬科,忍冬屬藍(lán)果忍冬的變種,又名山茄子、黑瞎子果等,其果實(shí)是一種藍(lán)黑色或紫色漿果,多為長圓形,味道微酸,略帶苦澀[1],主產(chǎn)于中國吉、黑、蒙等地,分布廣泛[2],具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。藍(lán)靛果中富含花色苷、黃酮類物質(zhì)、多酚等營養(yǎng)成分[3-5],其果實(shí)中花色苷含量較高。大量研究表明:花色苷具有抗氧化、抗癌、抗肝損傷、抗突變、預(yù)防糖尿病等作用[6-10]。隨著藍(lán)靛果大面積的種植、產(chǎn)量增加和加工技術(shù)不斷提高,市場(chǎng)上把藍(lán)靛果的鮮果加工成干果、凍干粉等形態(tài),因此,比較不同形態(tài)的藍(lán)靛果中花色苷的提取量,對(duì)藍(lán)靛果的儲(chǔ)運(yùn)具有重要的參考價(jià)值。

常見的花色苷提取方法有傳統(tǒng)的溶劑提取、超臨界流體萃取、酶提取及超聲輔助提取法等。超聲輔助提取法是采用超聲波輔助溶劑進(jìn)行提取,超聲波產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用,破壞物料細(xì)胞,使溶劑滲透到物料細(xì)胞中,縮短提取時(shí)間,提高提取率。相較于溶劑提取法,超聲輔助提取時(shí)間短、提取效率高[11-12];相較于超臨界流體萃取,超聲輔助提取法運(yùn)行成本較低;相較于酶提取法,超聲波的空化效應(yīng)保持花色苷的結(jié)構(gòu)和活性成分不變、更好地保護(hù)花色苷的結(jié)構(gòu)。

目前,影響超聲輔助提取法的因素有:乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率和料液比等。花色苷會(huì)被強(qiáng)大的沖擊波破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使其破裂,可以縮短提取時(shí)間和減少廢棄物的產(chǎn)生,超聲波時(shí)間過長使得花色苷剪切分子結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化致使提取量下降[13];花色苷會(huì)隨著超聲溫度的升高而增大其溶解度,過高的溫度也會(huì)降低花色苷的穩(wěn)定性,導(dǎo)致花色苷的降解,提取量反而下降[14]。花色苷通常在弱堿性或中性條件下不易提取且不穩(wěn)定,所以提取時(shí)通常采用酸化的乙醇溶液,酸化的乙醇溶液可以在提取時(shí)破壞植物細(xì)胞膜的同時(shí)溶解其中的花色苷。近年來,有關(guān)乙醇體積分?jǐn)?shù)變化影響鮮果中花色苷提取量的研究較多,如:周新宇等[15]在刺玫果花色苷最優(yōu)提取條件下可以得出乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%;李鳳鳳等[16]研究發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時(shí),對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量最佳。但有關(guān)乙醇體積分?jǐn)?shù)變化、超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)藍(lán)靛果干果和凍干粉中花色苷提取量影響的研究較少,需加強(qiáng)研究。

本研究以花色苷提取量為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),采用超聲輔助的方法,優(yōu)化乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度3個(gè)因素,確定不同形態(tài)的藍(lán)靛果(鮮果、干果和凍干粉)中花色苷的最佳提取方法;利用體外抗氧化活性方法評(píng)價(jià)不同形態(tài)的藍(lán)靛果中花色苷的清除自由基能力,確保花色苷的功效。同時(shí)對(duì)藍(lán)靛果的儲(chǔ)運(yùn)提供了一定的參考價(jià)值,有利于推動(dòng)藍(lán)靛果產(chǎn)品的深度開發(fā)和利用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

藍(lán)靛果鮮果,伊春市鑫野實(shí)業(yè)有限公司;藍(lán)靛果干果、凍干粉,黑龍江大興安嶺塔河縣綠野山產(chǎn)品開發(fā)有限公司。藍(lán)靛果鮮果、干果和凍干粉含水量分別為75%、14.50%和9.50%。

無水乙醇、濃HCl、K2S2O8、抗壞血酸(均為國產(chǎn)分析純)、DPPH、ABTS(均為阿拉丁試劑),北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

KQ-250E型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;UV-2600型紫外可見分光光度計(jì),島津儀器有限公司;FA1004B型電子天平,上海佑科儀器儀表有限公司;AQ-180E型粉碎機(jī),慈溪耐歐貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)靛果前處理

藍(lán)靛果鮮果和干果清洗后,晾干,分別密封在容量瓶里,凍干粉直接存入容量瓶密封,放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 藍(lán)靛果花色苷提取工藝

藍(lán)靛果前處理→粉碎至粗粉→按考察的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行超聲提取→重復(fù)浸提3次,抽濾后合并提取液→藍(lán)靛果花色苷粗提液→消光系數(shù)法計(jì)算提取量

1.2.3 藍(lán)靛果花色苷提取量測(cè)定

取制備的藍(lán)靛果花色苷提取液2 mL,定容到50 mL容量瓶中后振蕩并搖勻,用超純水做空白對(duì)照,在535 nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)孫興麗等[17]消光系數(shù)法測(cè)定花色苷提取量。花色苷提取量的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:OD,稀釋后溶液的吸光值;DV,稀釋倍數(shù);TEV,提取液總體積,mL;CrW,樣品質(zhì)量,g;98.2,1%的花色苷1 mol消光系數(shù)。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取5 g藍(lán)靛果鮮果、干果和凍干粉各5份,以藍(lán)靛果花色苷的提取量為衡量指標(biāo),分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度3個(gè)因素對(duì)花色苷提取量的影響,功率為100 W,乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、65%、80%、95%、100%[18],超聲時(shí)間0、10、20、30、40 min[19],超聲溫度20、25、30、35、40 ℃[20]條件下超聲提取,每個(gè)處理做3個(gè)平行。

1.2.5 DPPH自由基清除活性的測(cè)定

選取藍(lán)靛果干果提取液2 mL,稀釋成不同質(zhì)量濃度(0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/mL)定容至20 mL,實(shí)驗(yàn)備用。參照WANG等[21]的方法并稍作修改。用分析天平稱取2.0 mg的DPPH,用無水乙醇溶解并定容到50 mL的容量瓶中,配制成0.1 mmol/L的DPPH自由基溶液,吸取2 mL系列濃度藍(lán)靛果干果提取液置于比色管中,加入2 mL DPPH乙醇溶液充分混勻,避光反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)0,用2 mL的乙醇溶液分別代替系列濃度藍(lán)靛果干果提取液和DPPH乙醇溶液,重復(fù)上述操作,分別測(cè)定吸光度值A(chǔ)1和A2,用抗壞血酸作為陽性對(duì)照,平行測(cè)定3次,DPPH自由基清除率的計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:A0,樣品組吸光度值;A1,空白組吸光度值;A2,對(duì)照組吸光度值。

1.2.6 ABTS陽離子自由基清除活性的測(cè)定

(3)

式中:A0,空白組吸光度值;A1,樣品組吸光度值;A2,對(duì)照組吸光度值。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素試驗(yàn)中Duncan’s多重差異顯著性分析并計(jì)算樣品對(duì)各自由基清除能力為50%時(shí)的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖采用GraphPad Prism進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量的影響

如圖1所示,乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取量的影響具有顯著性差異(P<0.05)。在藍(lán)靛果凍干粉和干果中,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,花色苷的提取量也逐漸增加,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%時(shí),花色苷的提取量達(dá)到最大。藍(lán)靛果鮮果中,乙醇的體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí),花色苷的提取量達(dá)到峰值,與陳智玲等[23]采用超高壓提取藍(lán)莓渣花色苷的研究結(jié)果相似。而后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加,花色苷的提取量下降,可能是由于鮮果失去水分,含糖量升高使其不易溶解;另一方面65%的乙醇與藍(lán)靛果鮮果中的花色苷極性相似,在這種相似相溶的情況下,花色苷提取量最大,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí),溶液極性降低,花色苷無法被萃取出來,導(dǎo)致花色苷的提取量變少。因此,藍(lán)靛果凍干粉和干果提取花色苷的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%,鮮果提取花色苷的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on anthocyanins extraction注:小寫字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量的影響

如圖2所示,超聲時(shí)間在0～30 min時(shí),干果和鮮果花色苷提取量分別從20.11、8.76 mg/5 g上升至21.70、10.14 mg/5 g,經(jīng)SPSS 19.0顯著性分析,P=0.806(P>0.05)和P=0.203(P>0.05),說明超聲時(shí)間在0～30 min藍(lán)靛果花色苷提取量無顯著性差異,造成這種情況可能是干果和鮮果經(jīng)充分破碎和高速振蕩提取后,花色苷能快速溶出;凍干粉花色苷提取量從84.31 mg/5 g上升至121.1 mg/5 g,說明超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)靛果凍干粉花色苷提取量的影響差異顯著(P<0.05)。當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí),花色苷的提取量均達(dá)到峰值,但當(dāng)超聲時(shí)間延長為40 min時(shí),提取量略有下降,可能是超聲時(shí)間延長,花色苷的結(jié)構(gòu)被破壞,造成一些不被需要的雜質(zhì)也被萃取出[24],進(jìn)而影響花色苷的提取量。因此,花色苷提取的最適時(shí)間為30 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)花色苷提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on anthocyanin extraction

2.1.3 超聲溫度對(duì)藍(lán)靛果花色苷提取量的影響

如圖3所示,超聲溫度對(duì)藍(lán)靛果鮮果和干果花色苷提取量的影響具有顯著性差異(P<0.05),當(dāng)提取溫度處于20～35 ℃ 時(shí),藍(lán)靛果鮮果和干果花色苷提取量隨溫度升高急劇增加,但藍(lán)靛果凍干粉花色苷提取量隨溫度升高增加緩慢,凍干粉花色苷提取量從113.27 mg/5 g上升至120.57 mg/5 g,說明超聲時(shí)間在0～30 min之間無顯著性差異(P>0.05)。在35 ℃ 時(shí)提取量均達(dá)到峰值,這種現(xiàn)象和周麗萍等[25]采用超聲波輔助逆流提取蓓蕾藍(lán)靛果花色苷的特點(diǎn)相符合。溫度35～40 ℃時(shí),藍(lán)靛果花色苷提取量均略有下降,可能是由于溫度過高導(dǎo)致花色苷結(jié)構(gòu)遭到破壞,花色苷的提取量反而下降。因此,花色苷提取的最適溫度為35 ℃。

圖3 超聲溫度對(duì)花色苷提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on anthocyanin extraction

2.2 三種形態(tài)的藍(lán)靛果花色苷的提取量

如圖4所示,5 g藍(lán)靛果鮮果、干果和凍干粉中花色苷的提取量為10.40、22.20、121.50 mg,鮮果和干果中花色苷提取量與萬山[26]和張聰?shù)萚19]的研究結(jié)果相似。顯著性分析結(jié)果表明,鮮果,干果和凍干粉中花色苷提取量之間分別存在顯著性差異(P<0.05),因此,3種形態(tài)的藍(lán)靛果花色苷提取量之間存在顯著性差異(P<0.05)。藍(lán)靛果凍干粉花色苷提取量最高,其次是干果,鮮果花色苷提取量最少。干果的花色苷提取量高于鮮果的花色苷提取量,是因?yàn)橹谱魉{(lán)靛果干果時(shí)經(jīng)過干燥、晾曬等步驟,使得其中的水分大量蒸發(fā),重量減輕。但其中的花色苷沒有受到破壞,還因?yàn)樗稚⑹Ф鴿饪s,含量比鮮果高。參考李景等[27]的研究,可知1 kg干果由 6～7 kg鮮果才能制得,那么每5 g干果花色苷是由30～35 g鮮果制成,30～35 g藍(lán)靛果鮮果中花色苷的提取量為133.15～155.34 mg(根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推算),接近5 g藍(lán)靛果干果中花色苷的提取量,即是鮮果花色苷提取量的6倍。1 kg藍(lán)靛果凍干粉是由10～20 kg鮮果制得,每5 g藍(lán)靛果凍干粉花色苷是由50～100 g藍(lán)靛果鮮果制成,50～100 g藍(lán)靛果鮮果中花色苷的提取量為221.91～443.82 mg,凍干粉中花色苷的提取量遠(yuǎn)高于鮮果中花色苷提取量,這可能由于藍(lán)靛果鮮果制成凍干粉過程中的一些揮發(fā)性成分損失很小,能很好保留原有鮮果中的營養(yǎng)成分,使其組織結(jié)構(gòu)保存較好,含水量較低,致使相同提取條件下,藍(lán)靛果鮮果中花色苷的提取量遠(yuǎn)不及藍(lán)靛果凍干粉花色苷。

圖4 三種藍(lán)靛果中花色苷的提取量Fig.4 Extraction of anthocyanins from three kinds of L.edulis

2.3 抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 藍(lán)靛果凍干粉花色苷DPPH自由基清除能力

DPPH自由基存在單電子,在517 nm處,其醇溶液呈紫色[28]。因?yàn)榉磻?yīng)體系中的自由基清除劑能給DPPH自由基提供電子和氫原子,使單電子配對(duì),從而DPPH自由基溶液發(fā)生褪色。褪色程度越大說明清除DPPH自由基的能力越強(qiáng)[29]。如圖5所示,當(dāng)質(zhì)量濃度在0.02～0.1 mg/mL,藍(lán)靛果花色苷對(duì)DPPH自由基的清除能力顯著性增強(qiáng)(P<0.05)。藍(lán)靛果花色苷和維生素C溶液對(duì)照組在質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí),清除DPPH自由基的能力都達(dá)到最大,清除率分別為84.79%和98.54%。經(jīng)SPSS軟件計(jì)算得出藍(lán)靛果花色苷提取液和維生素C溶液對(duì)照組的IC50值分別為47.490和32.981 μg/mL。因此藍(lán)靛果花色苷提取液和維生素C溶液對(duì)照組對(duì)DPPH自由基均能較好地清除,且清除率隨質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。

圖5 花色苷和維生素C對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.5 DPPH free radical scavenging effect of anthocyanins and vitamin C

2.3.2 藍(lán)靛果凍干粉花色苷ABTS陽離子自由基清除能力

使ABTS溶液和K2S2O8溶液混合,從而氧化成綠色的ABTS陽離子自由基,當(dāng)抗氧化劑和ABTS陽離子起作用后ABTS陽離子的顏色消失,因此ABTS陽離子法廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)抗氧化劑清除自由基的能力,且方法簡單快速[30]。如圖6所示,藍(lán)靛果花色苷提取液和維生素C溶液對(duì)照組均具有一定的清除ABTS自由基能力,藍(lán)靛果花色苷提取液清除ABTS陽離子自由基能力弱于同濃度時(shí)維生素C溶液對(duì)照組(P<0.05)。當(dāng)質(zhì)量濃度在0.02～0.1 mg/mL,藍(lán)靛果花色苷提取液和維生素C溶液對(duì)照組對(duì)ABTS陽離子的清除率均隨質(zhì)量濃度增加而增加,通過SPSS軟件計(jì)算得出藍(lán)靛果花色苷提取液和維生素C溶液對(duì)照組對(duì)ABTS陽離子自由基清除能力的IC50值分別為59.600和38.661 μg/mL。

圖6 花色苷和維生素C對(duì)ABTS陽離子自由基的清除率Fig.6 ABTS cation free radical scavenging effect of anthocyanins and vitamin C

2.3.3 三種形態(tài)的藍(lán)靛果對(duì)DPPH和ABTS陽離子自由基清除能力

由表1可知,在最佳提取條件下,稀釋了25倍的藍(lán)靛果鮮果、干果和凍干粉提取液中花色苷的提取量并不一樣,但3種形態(tài)的藍(lán)靛果對(duì)于DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力沒有因?yàn)楣麑?shí)形態(tài)的變化而受到破壞,并且3種形態(tài)的藍(lán)靛果都對(duì)DPPH自由基和ABTS陽離子自由基有著極強(qiáng)的清除能力,這說明藍(lán)靛果中其他的成分也具有抗氧化性,還需進(jìn)一步的研究。

表1 三種形態(tài)的藍(lán)靛果對(duì)DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率Table 1 The scavenging efficiency of three kinds of Lonicera edulis to DPPH free radical and Abts free radical

3 結(jié)論

本文采用超聲波輔助提取3種形態(tài)的藍(lán)靛果(鮮果、干果和凍干粉)中的花色苷,通過單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn),確定最佳提取條件為:提取凍干粉和干果的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%;提取鮮果的最佳乙醇分?jǐn)?shù)為65%;3種形態(tài)的藍(lán)靛果的最佳超聲時(shí)間均為30 min、最佳超聲溫度均為35 ℃,且花色苷提取量變化為:凍干粉[(121.50±4.73) mg/5 g]>干果[(22.20±2.08) mg/5 g]>鮮果[(10.40±1.05) mg/5 g]。通過藍(lán)靛果花色苷的體外清除自由基實(shí)驗(yàn),表明與藍(lán)靛果鮮果和干果相比,凍干粉的抗氧化能力沒有削弱,其清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的IC50分別為47.490和59.600 μg/mL。綜上,相比較,凍干粉形態(tài)的藍(lán)靛果更具有儲(chǔ)存和運(yùn)輸優(yōu)勢(shì),為藍(lán)靛果產(chǎn)品的深加工提供一定的參考價(jià)值。