高效液相色譜-二極管陣列檢測器法對不同區域洋蔥中煙酸的質量評價

任興權,劉盼,王蓉,陶璐,趙爍,趙俊,霍文清,章學良*

1(酒泉市食品檢驗檢測中心,甘肅 酒泉, 735000)2(沈陽農業大學 食品學院,遼寧 沈陽, 110161)3(重慶工商大學 環境與資源學院,重慶, 400067)

洋蔥(AlliumcepaL.)是百合科、蔥屬多年生草本植物,別名玉蔥、蔥頭[1]。洋蔥是一種耐儲藏、便于流通的農作物,是一種世界性蔬菜,其栽培歷史強[2-3],現在更是為世界人民所喜愛。中國的新疆、甘肅、云南、山東等地都盛產洋蔥,洋蔥味道辛辣、鮮美、可口,是很好的飯菜佐料。洋蔥中富含各種營養物質,不光具有良好的食用效果,近幾年在藥用方面的研究也越來越多。洋蔥具有抗氧化[4]、抗腫瘤、清除自由基、抗衰老、防治心血管疾病等作用[5-6]。其中煙酸是洋蔥中一種重要的有效成分,本研究對洋蔥中的煙酸做出研究。

煙酸屬于維生素B系列化合物[7],又稱尼克酸、維生素B3、抗癩皮病因子,分子式為C6H5NO2,化學名稱吡啶-3-甲酸,呈白色結晶或結晶性粉末,無臭或有微臭,味微酸,水溶液顯酸性,是對于人體十分重要的營養成分,對于促進人體的正常生長發育十分重要。各種植物中都含有煙酸,但是含量差別較大[8]。

目前針對煙酸的提取方法主要有振蕩提取法[9]、直接浸取法[10-12]、微生物法[13]、固相萃取法[14]、超聲提取法[15]、微波提取法。對煙酸含量的研究主要有液相色譜法[16-20]、液相色譜-質譜法[9],毛細管電泳法[21-22],紫外可見分光光度計[23]。周琳[16]建立HPLC,使用梯度洗脫,選取250 nm測定了煙酸片中有關物質;譚建平等[17]建立高效液相色譜法用于煙酸注射液中煙酸的含量測定及有關物質檢查,該方法使用C18柱,檢測波長為262 nm;王艷等[18]建立反相高效液相色譜法,使用C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),在265 nm下同時測定多維元素片中煙酸、維生素B1、維生素B6、煙酰胺和維生素B2的方法;郝剛等[9]采用超高效液相色譜串聯質譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)的方法測定奶粉中煙酸含量,煙酸提取后經強陽離子交換固相萃取柱凈化,采用BEH-C18超高效液相色譜柱、20 mmol/L乙酸水溶液-乙腈(體積比為20∶80)流動相分離,以電噴霧離子源正離子方式進行多反應監測(multiple reaction monitorin, MRM),所建方法適合奶粉中煙酸的含量測定;曹江平等[23]建立了超聲、微波輔助酸解法,之后采用紫外可見分光光度計測定了枸杞中煙酸的含量。在研究中毛細管電泳法并不常見,很多實驗室都沒有毛細管電泳儀器,因而不如液相色譜法方便簡潔。紫外分光光度法測定煙酸定量相對穩定,但是因為提取基質復雜可能存在干擾,對定量研究產生影響,因而不如液相色譜法、液相色譜-質譜法來的定量準確。液相色譜-質譜法雖然定量準確,但是儀器貴重,大多實驗室沒法提供檢測。液相色譜法可以配合多種檢測器進行良好的定性定量,在測定的同時也能為制備色譜法制備煙酸提供參考依據,但是試驗表明現有報道的檢測煙酸液相色譜方法還不是很科學和準確,普遍存在提取不完全、加標回收率低等不足。

本研究在系統地分析總結現有方法的基礎上,通過與現有文獻報道的主要方法對比,試驗出了提取洋蔥中煙酸的新的前處理方法,并對高效液相色譜法的條件進行了優化選擇,方法操作簡單、檢測靈敏度高、穩定性好,為測定洋蔥中煙酸含量提供了方法支撐,同時對我國主要產區的洋蔥中煙酸的含量進行了研究,該方法及分析檢測數據可以應用到洋蔥提取物及功能性成分研究領域。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

洋蔥:市售。

甲醇、乙腈(色譜純),默克股份兩合公司;無水乙醇(分析純),天津市科密歐化學試劑有限公司;乙酸乙酯(色譜純),賽默飛世爾科技(中國)有限公司;甲酸(分析純),天津市凱信化學工業有限公司;煙酸標準品(C6H5NO2,CAS號:59-67-6,純度≥99.6%),德國Dr.Ehrenstorfer GmbH。

1.2 儀器與設備

1260型高效液相色譜儀、1290+6460型液質聯用儀,安捷倫科技有限公司;SP-756P型紫外分光光度計,上海光譜儀器有限公司;ME203/02天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;A2S-T-1024-BE超純水機,美國艾科浦國際有限公司;MS3型渦旋混合器,IKA公司;KH-600型超聲波清洗機,昆山禾創超聲儀器有限公司;TG16C型離心機,長沙英泰儀器有限公司;SQP型萬分之一電子天平,德國賽多利斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

用制樣器將樣品充分打碎,后混勻,裝入自封袋中,密封之后做好標記,在-20 ℃以下冷凍存放,稱樣前解凍后搖勻。

稱取樣品5 g(精確至0.01 g)于燒杯中,轉移樣品于25 mL容量瓶中,并用0.1%(體積分數)甲酸水定容,全部轉移至50 mL離心管中,渦旋1 min,之后超聲20 min,置于離心機中,在室溫條件下以10 000 r/min的速度,離心5 min,取上清液過微孔濾膜(0.22 μm,尼龍)后上機測定。

1.3.2 標準曲線溶液的配制

準確稱取10 mg煙酸標準品,用0.1%(體積分數,下同)甲酸水溶解,轉移至10 mL容量瓶中,用0.1%甲酸水定容,配制成1 mg/mL的標準儲備液;吸取適量標準儲備液用0.1%甲酸水稀釋成1、5、10、50、100 μg/mL的標準系列溶液。

1.3.3 高效液相色譜儀條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A:0.01%(體積分數)甲酸水溶液;流動相B:甲醇;流動相比例:A為90%,B為10%,流速:1.0 mL/min,柱溫:35 ℃,進樣量:10 μL,二級管陣列檢測器檢測范圍:190～400 nm,檢測波長:260 nm。

1.3.4 定性、定量方法

主要以煙酸保留時間定性,輔助以全掃描光譜定性進行二次確認,以外標法煙酸進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 提取方式的選擇

因煙酸的水溶液呈現酸性,在酸性條件下可以到達更好的提取效果。為了更好地提取洋蔥中的煙酸,分別對使用0.1%甲酸水提取法、0.1%甲酸乙醇提取法、0.1%甲酸甲醇提取法、0.1%甲酸乙酸乙酯提取法、0.1%甲酸乙腈提取法進行提取試驗對比,并且與現有文獻[19-20]報道比較新的方法進行比較,從表1可以看出以上溶液均能不同程度地提取洋蔥中的煙酸,0.1%甲酸水的提取效果最佳,比普遍認可的報道文獻方法更優。

表1 不同的試劑提取的效果的對比 單位:mg/kg

同時,對不同提取時間下洋蔥中煙酸提取的效果進行了提取研究,不同的提取效果見表2,發現超聲提取20 min就足以將洋蔥中的煙酸完全提取出來,更多的時間對于洋蔥中的煙酸提取效果沒有明顯的提升,反而浪費時間和資源。

表2 不同時間下提取效果的對比 單位:mg/kg

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 檢測波長的選擇

通過高效液相色譜-二極管陣列檢測器的全波長3D掃描功能,在190～400 nm波段內對槲皮素進行全掃描。通過掃描結果可知,煙酸在192 nm處有最強的紫外吸收,但是基線不平穩;而在260 nm處煙酸有最佳紫外吸收,有最大的信噪比,具體的圖譜見圖1,因而選取260 nm作為本實驗的檢測波長。

圖1 煙酸標準色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of nicotinic acid

2.2.2 色譜柱的選擇

C18色譜柱是液相色譜法最為常用的色譜柱,但是由于煙酸在水中會發生水解,致使煙酸峰型很差,必須在酸性流動相體系條件下才能出峰良好,因而在水相中加入0.1%的甲酸。加入甲酸致使流動相的酸性較強,一般的C18柱在該pH下分離效果會受到影響,且同時會影響色譜柱的壽命,所以本方法采用了Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),該色譜柱在硅膠制造和鍵合技術方面工藝先進,因此獲得了更優異的效果。在低pH流動相條件下的分離時,具有良好的色譜柱壽命和優異的重現性。結果表明Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)能夠很好地分離、檢測煙酸,基線平穩、波動小。

2.2.3 流動相的選擇

檢測煙酸的流動相體系一般是在酸性體系來檢測,乙腈比較適用于低波長,高波長則應選擇甲醇體系,通過比較0.1%磷酸水溶液體系、0.1%醋酸水溶液體系、0.1%甲酸水溶液體系和報道文獻[16-20]方法選擇的流動相體系發現,0.1%甲酸水溶液體系下煙酸的峰形更好,對稱性更好,沒有拖尾。因此,選用0.1%甲酸水溶液+甲醇的體系來測定洋蔥中煙酸的含量。

2.2.4 流動相比例的選擇

煙酸親水性較好,流動相采用梯度洗脫時煙酸和雜質的出峰時間過早,從而使得煙酸和雜質沒有很好地分離,且有基線波動會干擾檢測結果,致使煙酸檢測的效果不佳。而采用等度洗脫時,可以保持流動相體系的環境持續穩定,基線波動非常小,并且煙酸和雜質可以很好地分離,能夠準確地檢測煙酸,分析檢測洋蔥中煙酸色譜圖具體見圖2。

圖2 洋蔥中煙酸的色譜圖Fig.2 Chromatogram of nicotinic acid in onion

2.3 標準曲線

該方法的標準曲線以質量濃度(X,μg/mL)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標,在煙酸標準溶液濃度1～100 μg/mL,標準曲線的相關系數(R)范圍為0.999 91～0.999 98,煙酸標準溶液的線性關系良好,滿足洋蔥中煙酸定量分析的要求。

2.4 檢出限和定量限

以0.1%甲酸水作空白基質,在其中加入低濃度煙酸標準品,確定該方法中煙酸的方法檢出限為0.15 mg/kg,定量限為0.50 mg/kg,可見本方法的檢出限和定量限非常低,說明本方法的響應好,靈敏度高。

2.5 回收率、精密度和煙酸穩定性

選用煙酸含量合適的洋蔥,在其中添加10.0、20.0、30.0 μg/mL 3個濃度的煙酸標準溶液,按照本方法樣品前處理方法進行處理,每個加標樣品平行測定6次,從表3可以看出本實驗中煙酸的加標回收率為98%～103%,相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)為0.08%～0.11%,說明該檢測方法的準確度和精密度很好,非常適用于洋蔥中煙酸的分析檢測。

表3 煙酸的回收率和精密度Table 3 Recoveries and RSDs of nicotinic acid

標準樣品在常溫放置24 h之后進樣,標準樣品濃度減小0.32%～0.59%,樣品穩定性很好。

2.6 與報道文獻方法的對比

分別用本方法與已報道的周琳[16]建立的使用梯度洗脫并選取250 nm測定了煙酸片中有關物質、譚建平等[17]建立高效液相色譜法用于煙酸注射液中煙酸的含量測定及有關物質檢查、王艷等[18]建立反相高效液相色譜法在265 nm同時測定多維元素片中煙酸、維生素B1、維生素B6、煙酰胺和維生素B2的方法、郝剛等[9]采用UPLC-MS/MS測定奶粉中煙酸含量的方法、曹江平等[23]建立了超聲、微波輔助酸解法前處理法之后采用紫外可見分光光度計測定了枸杞中煙酸的含量的相關提取分析方法對同一黃洋蔥進行了分析對比,具體分析檢測的結果見表4,很明顯本方法測得的含量比報道方法測得的含量高的多,同時在黃洋蔥中添加25 μg /mL的煙酸標準溶液后前處理及分析檢測,本方法的加標回收率為99%,報道文獻方法的加標回收率為49%～66%,具體見圖3,通過試驗證明本方法更優于已報道的方法。

圖3 本方法與報道方法的加標回收率對比Fig.3 Comparison of spiked recoveries between this method and the reported method

表4 本方法與報道方法檢測結果的對比 單位:mg/kg

2.7 洋蔥樣品分析

對不同品種洋蔥和洋蔥的不同部位中的煙酸含量進行了研究測試,從檢測結果發現,不同洋蔥中煙酸含量差別較大,具體結果見表5,不同品種洋蔥中的煙酸含量差別較大,黃洋蔥和紫洋蔥中的煙酸含量較高;同一品種洋蔥中,洋蔥越新鮮洋蔥中煙酸含量越高;同一洋蔥中不同部位的煙酸含量差別較大,見表6,洋蔥表皮的煙酸含量小于洋蔥中心的煙酸含量,規律呈現出越接近洋蔥內部煙酸含量越高。

表5 不同洋蔥中煙酸含量對比 單位:mg/kg

表6 洋蔥中不同部位煙酸含量對比 單位:mg/kg

2.8 不同主產區洋蔥中煙酸的質量評價

我國的洋蔥主要產區在甘肅、新疆、吉林、黑龍江、內蒙古、山東、四川、云南,因為不同地域的氣候和地質差別比較大,通過分析檢測發現不同地域的洋蔥的煙酸含量有很大差異,其中甘肅、新疆產的洋蔥中的煙酸含量較高,尤其是甘肅酒泉產的最高,含量可達到32 mg/kg,應與該地域的沙土地質和晝夜溫差大有一定的關聯,不同地域的洋蔥中煙酸的含量見圖4。以洋蔥中煙酸的含量為指標對洋蔥進行質量評價,甘肅酒泉產的洋蔥質量等級最高,依次是新疆石河子、吉林延吉、黑龍江齊齊哈爾產的為中等,再次是內蒙古通遼、云南元謀、山東濰坊、四川西昌產的為低一等級,北方種植的洋蔥質量等級普遍較高。

圖4 不同區域洋蔥中煙酸的含量Fig.4 Content of nicotinic acid in onion from different regions

3 結論

煙酸是洋蔥中很重要的營養成分,本次研究建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定洋蔥中煙酸的方法。利用0.1%甲酸水超聲提取,以高效液相色譜-二極管陣列檢測器進行定性和定量的分析,該方法前處理簡單快速,實驗靈敏度高,具有精密度、準確度好等特點,有效地解決了現有國內外報道方法中普遍存在的提取效果不佳、檢測不準確的問題,適用于洋蔥中煙酸含量的檢測分析,同時分析檢測了主要產區洋蔥中煙酸的含量,可為洋蔥的品質篩選、功能性成分研究和深加工提供有效依據。