谷氨酸棒桿菌細胞工廠育種策略以及高通量篩選技術的研究進展

李業,孟麗虹,嚴豪,白仲虎*

1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)2(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)3(清華大學 深圳國際研究生院生物醫藥與健康工程研究院,廣東 深圳,518000)

依靠不可再生原料的化工、能源、醫藥等傳統制造業以“高排放、高污染”的加工模式對生態環境造成巨大影響,在全球倡導發展綠色低碳循環經濟體系的趨勢下,傳統制造業面臨綠色轉型的嚴峻挑戰[1]。具有原料再生、過程高效清潔優良特征的生物制造作為生物經濟戰略性新興產業發展方向,利用生物有機體進行高質量的綠色生產,有望推動生物技術融合工業制造,變革未來物質加工和生產模式,實現綠色可持續發展[2]。

工業微生物細胞工廠是綠色生物制造的前提,其利用天然可再生原料通過自身代謝網絡合成“高價值、低能耗”的各類物質,也可實現廢棄物回收利用,提高資源利用率[3]。目前微生物細胞工廠已廣泛應用于輕工業、化工、能源、環保、生物防治等領域生產食品、藥品、生物環保材料和生物制劑等。但是,迄今為止我國自主研發的成熟高性能工業微生物細胞工廠仍然較少,其生產水平距國際大公司先進工業微生物細胞工廠仍存在一定差距。因此,開展我國自主工業微生物細胞工廠的設計創制研究,是保障我國生物制造產業綠色可持續發展的關鍵[4]。

為了建立具有優良性狀的高效微生物細胞工廠,對微生物為底盤的工業菌株進行多維度的改造與構建,通過多輪“設計-構建-測試-學習”(design-build-test-learning,DBTL)循環以達到以下目的[5]:(1)提高微生物細胞的生長速率;(2)擴大底物譜及增強底物轉化效率;(3)提高目標產物的產量和質量;(4)增強微生物底盤細胞的魯棒性和耐受性;(5)優化目標產物生產分離方式,減少下游產業成本等。對此研究人員融合“建物致知”和“建物致用”的理念開發了許多育種策略,主要包括傳統的誘變育種策略和新型的理性、非理性育種策略以創制微生物細胞工廠[6]。

由于谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)具有公認食品安全(Generally Regarded As Safe, GRAS)的特性,已成為工業生產的模式微生物之一,被應用于構建綠色高效的微生物細胞工廠[7]。20世紀50年代后已被廣泛用于大規模生產L-氨基酸,隨著基因工程、代謝工程和分子生物學等學科的發展,它也被用于工業生產高價值產品,包括有機酸、聚合物前體、高級醇和蛋白質等。而該菌株的非致病性、無芽孢、迅速生長、無內毒素,有完整的分泌途徑,胞外水解酶活性較低的優良性狀使其備受關注[8]。近年來,基因編輯技術、代謝調控技術和高通量篩選技術的快速發展,顯著加速了工業菌種的改造提升與工業化應用,也推動了生物制造領域的進步[9]。本文針對谷氨酸棒桿菌的育種策略和高通量篩選結合實際案例進行綜述,介紹了傳統及新型育種策略,并展望了生物技術與人工智能融合對未來微生物細胞工廠的潛在應用。

1 谷氨酸棒桿菌育種策略

從自然界中分離得到的谷氨酸棒桿菌,其性狀遠不能滿足工業生產的需要,因此如何對微生物底盤進行提升,以獲得高產高效的工業微生物細胞工廠就成為了工業應用的關鍵。而微生物育種的策略主要包括傳統育種和新型育種,傳統育種方式主要采用誘變育種,是指在人為條件下,利用物理、化學、生物因素,誘發生物體產生突變,從中選擇、培育植物和微生物新品種的方法,而隨著合成生物學、代謝工程、基因編輯技術、多種組學以及各種交叉學科的深入研究,使得微生物細胞工廠創制技術得到了不斷的發展和創新[6],發展的新型育種包括非理性的重離子輻射、常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變育種、適應性進化育種,理性的基因編輯等,這些技術和手段都為獲得優質的微生物底盤細胞提供了便利[10]。

1.1 傳統育種策略

誘變育種作為傳統的微生物育種技術被廣泛應用于生物領域,包括物理誘變、化學誘變、生物誘變及復合誘變[11]。如圖1所示,它不需要復雜的基因操作及代謝網絡調控知識,方便快捷、成本較低及成功率較高,因此為微生物選育提供了便利。

圖1 提高重組蛋白產量的主要方法[11]Fig.1 The main method to increase the yield of recombinant protein[11]

物理誘變主要利用電離輻射如X-射線、γ-射線和來自放射性物質及非電離輻射如紫外線、激光、微波等物理誘變因素,加速微生物的突變率。電離輻射能量極高,能使構成基因的化學物質直接發生電離作用,從而形成變異。非電離輻射的能量較低,只能產生激發作用,其中紫外線照射是最常采用的方法之一,紫外線可使DNA分子形成嘧啶二聚體,阻礙堿基正常配對,引起突變或死亡[12]。陳曉博等[13]通過紫外線誘變谷氨酸棒桿菌出發菌株BC001,用結構類似物D-精氨酸平板篩選獲得高產L-精氨酸的BC307突變株,產量提升至2.94 g/L。

化學誘變主要利用一些化學物質以提高生物的突變率,其可以使DNA分子發生烷化、錯配或移碼,影響mRNA的轉錄,造成功能蛋白重組,表型改變[14]。常用的化學誘變劑如烷化劑、堿基類似物、移碼誘變劑等。例如,ZHANG等[15]先通過沉默丙酮酸脫氫酶基因復合物并敲除乳酸脫氫酶基因,然后通過硫酸二乙酯誘變獲得高產3-甲基-1-丁醇的谷氨酸棒桿菌突變體,其產量高達659 mg/L。

生物誘變通過提高基因重組頻率獲得新的遺傳型,主要包括噬菌體、DNA轉座子誘變和原生質體融合、基因組重排等。其中原生質體融合是一種很重要的菌種改良技術,可將遺傳性狀不同的親株細胞進行隨機融合,借以獲得兼有雙親優良性狀的穩定重組子[16]。它打破了物種間界限,實現遠緣菌株的基因重組,為誘變育種提供了一種有效手段。張婧芳等[17]將谷氨酸棒桿菌GS538和谷氨酸高產菌S9114進行原生質體融合,定向選育出1株高產L-鳥氨酸的RH169菌株,產量可達19.3 g/L。

復合誘變是采用2種或多種誘變劑同時處理或先后使用。因為菌株長期使用同種誘變劑后,會產生“疲勞效應”,同時會出現菌株生長周期延長、代謝減慢、回復突變等問題,而研究表明復合誘變具有協同效應,較單一因子誘變有很大優勢[11]。例如,PARK等[18]用N-甲基-N-亞硝基-N′-硝基胍和紫外線處理谷氨酸棒桿菌AR0菌株,成功獲得耐10 g/L精氨酸羥酸酯和30 g/L刀豆氨酸的AR1突變菌株,AR1經分批補料培養后L-精氨酸產量達34.2 g/L,比在相同條件下培養的AR0菌株獲得的L-精氨酸高2倍以上。

1.2 新型育種策略

隨著科學技術的發展,多種新型育種策略的出現為創制工業微生物細胞工廠注入了新的活力,主要分為非理性的育種策略和理性的育種策略。非理性的育種策略包括重離子輻射、ARTP誘變技術及適應性進化等策略。理性育種策略是基于合成生物學、基因編輯技術及微生物代謝網絡的深入研究,應用理性設計構建優良的微生物細胞工廠[19]。

1.2.1 非理性育種策略

相比存在一定的安全風險的傳統育種技術,近年來發展的新型育種技術[20]更加安全高效。例如重離子輻射、ARTP等有無毒無害、突變率高、遺傳穩定等優點,適應性進化具有能夠提供足夠的遺傳多樣性,積累豐富的有益突變體等特點,這些技術加速了優良微生物細胞工廠的構建。

重離子輻射在其穿透的路徑上有較大的能量沉積,產生很強的局部電離,與傳統的光子輻射相比具有較高的生物學相對效應,已經廣泛應用于生物育種、疾病診斷和治療[21]。繆建順等[22]通過12C6+束輻照誘變谷氨酸棒桿菌,經篩選后獲得谷氨酸高產菌株GM006,其產量最高達121.1 g/L,比原始菌株提高10.09%。

ARTP誘變是1種新近開發的安全物理誘變育種技術[23],如圖2所示,主要采用He作為誘變源,能夠在大氣壓下產生溫度在25～40 ℃的高活性粒子濃度的等離子體射流,包含多種化學活性粒子,如激發態的氦原子、氧原子、氮原子、·OH自由基等。這些粒子能夠改變微生物細胞壁膜的結構及通透性,對遺傳物質造成損傷,誘發生物細胞啟動容錯率高的SOS修復機制,從而獲得遺傳穩定的突變菌株。與其他誘變方法相比,ARTP具有突變率高、突變頻譜廣、操作簡單、安全性高、環境友好等特點,目前已廣泛應用于包括細菌、放線菌、真菌、酵母等在內的100多種微生物誘變育種。例如,ZHAO等[24]通過ARTP誘變產生累積19.4 g/L的L-精氨酸的突變菌株,并通過發酵優化進一步提升L-精氨酸產量獲得高達71.3 g/L的突變株。LV等[25]利用ARTP誘變及高通量篩選獲得了高產L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌,發酵終質量濃度為(25.7±2.7) g/L,并通過理性改造進一步改善L-谷氨酰胺的生產,使L-谷氨酰胺發酵終質量濃度增加了186.0%,達到(73.5±3.1)g/L。

a-以直接作用模式使用大氣壓DBD等離子體處理生物體;b-以間接作用方式使用射頻APGD等離子體射流處理生物體圖2 ARTP誘變2種模式原理[23]Fig.2 Principle of two modes of ARTP mutagenesis[23]

對于缺乏遺傳背景或與表型特征相互影響的微生物,可以采用具有獨特優勢的適應性實驗室進化(adaptive laboratory evolution,ALE)。ALE是在實驗室條件下,借助人工選擇壓力,通過微生物自發突變的不斷富集實現微生物的定向進化,并從進化群體中篩選優良性狀個體的一種方法,其作為定向誘變已被廣泛應用于提高微生物產物產量、生長速度、脅迫耐受力和底物利用率等研究[26]。例如TUYISHIME等[27]利用ALE成功獲得高甲醇利用率的谷氨酸棒桿菌,突變體在甲醇-木糖最小培養基上顯示出細胞生長增加20倍,并利用甲醇和木糖,物質的量比達3.83∶1。KRüGER等[28]通過ALE增強谷氨酸棒狀桿菌的耐受性,使其適應血紅素水平的增加,分離的菌株顯示出對濃度高達100 μmol/L的血紅素生長的高度耐受性。徐美娟等[29]還闡述了谷氨酸棒桿菌抗各種環境脅迫機制,并總結了提高谷氨酸棒桿菌魯棒性和耐受性的合成生物學新策略。

1.2.2 理性育種策略

隨著代謝工程、合成生物學及全基因組測序的發展,加速了研究人員對微生物代謝調控機制的深入了解,對微生物細胞工廠的創制也從非理性的育種策略轉變為更為理性的育種方式,其理性改造主要有以下策略[30]:

(1)生物合成元件及代謝途徑的挖掘和優化[31]。經典的基因表達調控元件包括5′非編碼區、啟動子、核糖體結合位點(ribosome-binding site,RBS)、終止子等能夠有效調控轉錄水平和翻譯水平,但由于細胞基因水平的調控是復雜的、多元化的過程,經典的基因表達調控元件不能滿足精準調控的強度,因此研究人員也開發了多種新型基因調控元件,如核糖開關、核酸適配體等,在調控蛋白表達水平、改變細胞物質代謝等過程中發揮了重要作用。例如,WEN等[32]將谷氨酸棒桿菌S9114進行代謝工程改造,并調節基因odhA的RBS序列以減弱α-氧戊二酸脫氫酶復合物活性,實現谷氨酸在生物素過量的玉米秸稈水解物中的高效積累,使谷氨酸積累量升高6倍以上。

基因編輯技術的發展使研究人員能夠更為理性的改善微生物底盤的自身性能,可以挖掘內源性物質代謝途徑,并利用過表達代謝途徑中的關鍵基因,消除產物反饋抑制等方式進行優化,也可以通過對代謝網絡的解析,構建異源代謝的最佳途徑,從而提高目標產物合成路徑的精確性[7]。例如WANG等[33]通過敲除ltbR轉錄調控因子,過表達L-亮氨酸合成途徑的關鍵基因,包括ilvC、leuDH、rocG,從而獲得L-亮氨酸產量達(23.31±0.24) g/L的高產菌株。

(2)代謝流量動態調控

細胞代謝網絡存在復雜的調控機制,對微生物底盤進行單一調控元件或代謝途徑的改造可能會引起代謝失衡,不利于構建高效的工業化微生物細胞工廠,因此對微生物底盤進行全局性的代謝流量動態調控是必要的。常用的代謝流量動態調控策略包括調控關鍵酶、強化底物利用過程中的能量供給、優化目標產物合成過程中的碳通量和氧化還原平衡等[34]。

細胞的代謝通過“基因-酶-反應”組成了基因組代謝網絡模型,多種酶參與的代謝途徑普遍存在代謝失衡,導致中間代謝物積累,影響目標產物的轉化效率。因此,可以通過強化關鍵酶的性能和產量、削弱支路副產物的關鍵酶,來提高代謝途徑的整體催化效率。優化底物利用過程中能量供給以提高利用率,也可以通過構建廉價碳或氮源底物利用途徑來降低能源成本。細胞在代謝過程中會產生和消耗能量,若供給量小于需求量,會影響目標產物的合成效率,因此需要對代謝途徑中碳通量和氧化還原平衡進行優化[35],實現動態調控。例如XU等[36]通過理性改造依賴于NAD(P)H的二氫二吡啶酸還原酶,改變了其氧化還原通量,從而提高了谷氨酸棒桿菌中L-賴氨酸的產量[2.93 g/(L·h)],其碳產量從0.35 g/g葡萄糖提高到0.44 g/g葡萄糖。

(3)大規模基因編輯

隨著基因編輯技術、高通量篩選及生物信息學的發展,為創制綠色高效的微生物細胞工廠提供了更多有力工具。傳統的基因編輯技術基于同源重組以實現目的基因的敲除、敲入和突變,但由于其低效率限制了底盤細胞改造的效率和通量,不能滿足全基因組范圍大量基因編輯的需求。近年來,新一代基因編輯技術 CRISPR/Cas系統發展迅速,因其具有效率高、操作便捷、成本低等優點,已廣泛應用于多種真核和原核生物的基因組編輯。迄今為止,NCBI數據庫已經收錄了79株全基因組測序的谷氨酸棒桿菌,且研究人員開發了完備的基因組編輯系統,如CRISPR-Cas9系統、CRISPR-Cpf1/dCpf1系統及RE-CRISPR系統等,推動了谷氨酸棒桿菌底盤細胞的優化改造[37]。目前主要通過“自上而下的基因組精簡”和“自下而上的基因組合成”2種策略進行底盤細胞構建。LIU等[38]通過優化谷氨酸棒桿菌的CRISPR系統并利用CRISPR輔助的染色體編輯和CRISPRi陣列篩選用于工程關鍵酶,微調代謝通量和提高L-脯氨酸產量,最終獲得L-脯氨酸產量達到142.4 g/L的高產菌株。SUN等[39]建立了基于人工合成sRNA的基因表達沉默技術,實現了染色體基因表達的快速下調,單基因弱化效率達到80%以上。

2 高通量篩選技術

微生物細胞工廠通過理性/非理性的改造,會產生大量非目標性的個體,尤其是非理性改造會產生大型突變文庫,需要從其中篩選出理想性狀的底盤細胞具有很大挑戰性。傳統的瓊脂平板篩選法、搖瓶篩選方法和微孔板篩選方法是目前最常用的篩選方法,其作為簡單易行的初篩方法,可用于排除大量無活性和極低活性的微生物。但由于微生物改造所產生的巨大文庫,通過傳統篩選方式不僅通量低、效率低下且成本昂貴。為克服以上問題,近年來已開發了多種高通量篩選技術及設備[40],如自動化液體處理平臺、熒光激活細胞分選技術(fluorescence-activated cell sorting,FACS)、液滴微流控分選技術(droplet-based microfluidic sorting,DMFS)和基于生物傳感器篩選策略等,用于高效篩選具有目標性狀的微生物底盤細胞。

2.1 高通量自動化液體處理平臺

早期的高通量篩選主要采用多孔板進行微生物細胞的檢測篩選,可以實現樣品與試劑的添加、培養和檢測,包括24、48、96和384孔板。多孔板培養結合自動化液體處理平臺,每天處理樣品高達104個,顯著提升篩選速率。目前已經開發了多種全自動處理工作站,利用軟件程序推動自動化液體處理平臺與多種檢測儀器組合的無縫集成[41],包括微孔板檢測儀、細胞成像系統、洗板機、分液器、自動培養箱和儲板器等,極大縮短了手動操作時間,通過更高效的工作流程提高實驗室生產率,這些系統已應用于微生物工程菌株選育、藥物篩選、微生物高內涵分析等,是不可或缺的初期醫藥研發工具。例如RAJ等[42]開發了一種環保的高通量自動化篩選平臺,能夠快速有效地建立表型酶和微生物菌株的微孔板篩選實驗,加速實現DBTL循環,研究者成功利用該平臺在厭氧條件下生產烯酸還原酶,并進行了烯酸還原酶最大活性的最佳pH值篩選,發現其在pH 5～6下工作最佳。

2.2 熒光激活細胞分選技術

FACS是流式細胞術的一種特殊技術[43],如圖3所示,它是利用激光束激發將基因型和表型偶聯的微生物細胞中的熒光標記物,通過光學系統收集并分析每個細胞的光散射和熒光信號,再根據設定的參數將細胞按照特定的性質進行分選,分選速率高達107克隆/h,是一種高效分析和分選微生物細胞的工具,也是目前最常用和成熟的細胞高通量篩選技術,已廣泛應用于新藥研發、醫學研究、臨床診斷等多種領域中。例如ZHANG等[44]通過ARTP誘變提高谷氨酸ΔSSAAI菌株的L-絲氨酸產率,構建了基于NCgl0581響應L-絲氨酸的濃度的生物傳感器,利用FACS從大型誘變庫中成功分選出高產L-絲氨酸的谷氨酸C36-pDser菌株,累積量為34.78 g/L,蔗糖產量為0.35 g/g,分別比親本菌株高35.9%和66.7%。

圖3 流式細胞分選原理簡圖[43]Fig.3 Schematic diagram of flow cell sorting[43]

2.3 液滴微流控分選技術

近年來,DMFS發展迅速,已成為強大的超高通量篩選工具[45],其通過液滴生成、液滴培養及液滴檢測分選,從大量的液滴中分離出目標液滴,獲得高效的微生物底盤細胞。納升至皮升級液滴作為微反應器,常采用油包水的形式做區室化反應,同時適用胞內表達和胞外分泌,具有通量高、速度快、體積微小、均一性好、單分散性良好等特點,為醫藥、食品、環保研究等搭建了一個全新的平臺。目前液滴微流控技術已經在生命科學研究中有不同的應用[46],例如高通量篩選細胞藥物、單細胞組學研究,并結合細胞測序形成單細胞高通量液滴測序技術,以繪制整個細胞亞群的基因組圖譜、適應性進化、開發藥物輸送系統等。

基于不同的分選參數開發了有多種檢測技術,典型的檢測技術如熒光激活液滴分選技術(fluorescence-activated droplet sorting,FADS),它的應用最為廣泛,已成為微生物工程菌株液滴分選的主要方式。JIANG等[47]綜述了不同分析物質利用FADS研究的最新進展,并根據熒光偶聯策略原理,將其分為4大類,包括熒光底物分析策略、酶聯熒光分析策略、基于生物傳感器熒光偶聯策略以及基于抗體親和力熒光偶聯策略。然而,有許多天然酶或代謝物是非熒光的,因此限制了FADS的適用性。為了克服這些問題,其他檢測技術也被開發,例如吸光度激活液滴分選技術、吸光度激活液滴分選技術、質譜液滴分選技術等。

目前基于DMFS開發了微型化、自動化、智能化的全自動高通量微生物液滴培養儀(microbial microdroplet culture system,MMC),可用于單細胞微生物篩選,進行生長曲線測定、壓力富集、適應性進化及菌種耐藥性研究等[48]。鄧磊等[49]利用ARTP誘變技術及MMC選育組氨酸結構類似物的抗性突變株,成功從耐受3-氨基-1,2,4-三氮唑10 g/L和D-組氨酸8 g/L的抗性突變株中篩選得到谷氨酸棒桿菌Cg-F4,其L-組氨酸產量為0.561±0.016 g/L。YU等[50]建立第一個谷氨酸棒桿菌基因組規模CRISPRi干擾文庫,同時集成了FlAsH-四半胱氨酸驅動的FADS技術,如圖4所示,開發了一個工程化高通量的CRISPRi-微流體篩選平臺,并成功應用該平臺增強了谷氨酸棒狀桿菌中多種重組蛋白分泌產量。

2.4 基于生物傳感器的高通量篩選策略

生物傳感器是合成生物學和代謝工程的重要組成部分,可以將生物物質濃度轉變為電信號、光信號等易于檢測的信號,具有靈敏度高、特異性強、分析速度快的特點,因此被認為是動態調控、篩選理想表型的強大裝置。常用的生物傳感器主要包括基于熒光蛋白的生物傳感器、基于核酸的生物傳感器、基于轉錄調控因子的生物傳感器和基于雙組分系統的生物傳感器等[51]。近年來生物傳感器已應用于目標化合物濃度檢測、高通量篩選、定向進化和代謝動態控制等方面,為加快構建微生物細胞工廠提供了有力工具。STELLA等[52]開發了一種基于轉錄因子的生物傳感器,通過整合pfkA和Lrp,將谷氨酸棒狀桿菌的生長與支鏈氨基酸的細胞內濃度耦合,從而增強氨基酸的產生。TAN等[53]利用L-異亮氨酸生物傳感器篩選得到對L-異亮氨酸響應增強的突變啟動子PbrnFE7,獲得高產4-羥基-L-異亮氨酸谷氨酸棒桿菌ST17,產量達到135.3 mmol/L。

3 展望

微生物細胞工廠的構建以滿足工業需求為導向加快市場應用,經過多年的研究積累,谷氨酸棒桿菌從誘變育種到基于先驗知識和模擬計算理性設計,利用新型技術對微生物底盤進行改造,達到“建物致用”的目標,應用基因型-表型關聯技術,通過高通量篩選獲得不同特性的工業微生物細胞工廠,極大提高了谷氨酸棒桿菌細胞工廠的創制效率,然而細胞工廠物質和能量代謝受時空的影響及復雜多元化的代謝調控網絡仍然是制約其工業應用的瓶頸[54]。盡管目前的改造和檢測手段眾多,能夠從多方面獲取不同優良性狀的微生物底盤,但目前的技術和日益增長的微生物細胞工廠需求依然存在巨大差異,缺乏對多層次信息的理解和應用。

隨著合成生物學、生物信息學及人工智能的發展,有望克服這些難題,使得包括先進的人工智能輔助設計、復雜基因網絡動態調控、基因組編輯、超高通量篩選、智能檢測、智能自動化生物平臺在內的前沿技術的結合將合成生物推向下一個階段[55],實現生物制造到生物智造的變革,突破合成生物學科技創新,開發出更為經濟、高效、可持續發展的工業微生物細胞工廠,加快推動生物智造在輕化工、醫藥、能源等領域的規模化應用,完善生物產業技術體系,使生物經濟實現高質量發展。