天珠散對缺血性腦卒中大鼠神經功能缺損及Wnt3a、MAP-2表達的影響

程 剛,付平方,殷 莉,包江平,蘭 俊,匡穎文,吳云毅

(1. 十堰市中西醫結合醫院,湖北 十堰 442000;2. 十堰市食品藥品檢驗檢測所,湖北 十堰 442000;3. 貴州中醫藥大學第一附屬醫院,貴州 貴陽 550001)

腦卒中系腦組織損傷的一組急性腦血管疾病,通常表現為出血性和缺血性兩大臨床分型,可導致肢體癱瘓、言語障礙、吞咽困難、認知障礙和精神抑郁等,具有發病率高、致殘率高、病死率高、復發率高及經濟負擔高的“五高”特點[1]。缺血性腦卒中(即腦梗死)占所有卒中的75%以上,臨床上常針對性采用溶栓、抗血小板、抗凝、神經保護以及控制血壓、血脂、血糖等非特異性治療[2]。目前快速恢復血管的血氧供應是公認獲益措施,但血管再通微環境的改變往往進一步加重缺血組織結構與功能的障礙,故修復降低腦缺血再灌注損傷導致的神經功能缺損成為治療的重點。腦缺血再灌注損傷的發生常涉及能量代謝障礙、Ca2+超載、炎癥反應、細胞凋亡、氧自由基損傷、興奮性氨基酸毒性等多環節[3-5],而Wnt信號通過調控神經干細胞增殖分化和突觸形成與腦缺血再灌注損傷病理機制密切相關[6]。微管相關蛋白2(MAP-2)是神經生長和修復相關蛋白,對腦缺血非常敏感,是神經元缺血損傷的分子指標,常為神經可塑性研究的理想標志物[7-8]。中藥復方通過辨證化裁防治腦卒中可發揮多成分、多靶點、多途徑的優勢和潛力。源于《鄂西藥物志》的天珠散由頭頂一顆珠和天麻組成,具補虛強體、鎮靜安神、祛風散痰、補腦安神之效,對血管性癡呆及學習記憶障礙等有保護作用[9-11]。然其作為土家、苗族民間地域特色驗方應用并未普及,歷史文獻和現代藥理研究資料仍十分匱乏,均在不同程度限制了天珠散的開發和推廣。本研究通過建立局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型,進一步觀察了天珠散對腦缺血再灌注損傷及Wnt3a、MAP-2蛋白表達的影響,探討其抗腦缺血神經保護機制。

1 實驗材料與方法

1.1動物 SPF級雄性SD大鼠90只,6～8周齡,體重(200±20)g,購自湖北省實驗動物研究中心[許可證號:SCXK(鄂)2020-0018],飼養于武漢大學附屬人民醫院實驗動物中心[許可證號:SYXK(鄂)2017-0065],室溫20～25 ℃,相對濕度50%～60%,自由進食飲水,適應性飼養5 d后進行實驗。本實驗經十堰市中西醫結合醫院實驗動物倫理委員會批準(202003)。

1.2藥物 頭頂一顆珠(批號:191210)、天麻(批號:210801)均購于十堰華源三江醫藥有限公司,經湖北省中醫院嚴勁松主任藥師鑒定分別為百合科延齡草屬植物延齡草(TrilliumtschonoskiiMaxim.)的干燥根及根莖和蘭科天麻屬植物天麻(GastrodiaelataBl.)的干燥塊莖;天珠散超微粉(300目)由十堰市宏康醫藥有限公司按藥材比1∶2制備;尼莫地平片(亞寶藥業集團股份有限公司,批號:211211)。

1.3主要試劑與儀器 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,Sigma公司,批號:T8877-25G);蘇木素(Sigma公司,批號:H9627);伊紅(國藥集團,批號:71014544);苯甲磺酰氟(100 mM PMSF,Beyotime公司,批號:ST506);RIPA裂解液(強)(Beyotime公司,批號:P0013B);BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime公司,批號:P0010);SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×,Beyotime公司,批號:P0015);SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(Beyotime公司,批號:P0012A);化學發光底物(ECL,Thermo Fisher公司,批號:NCI5079);預染蛋白Marker(10-250KD,Thermo Fisher公司,批號:26619-1);PVDF膜(Millipore公司,批號:IPVH00010);Wnt3a單抗(proteintech公司,批號:26744-1-AP)、GAPDH單抗(proteintech公司,批號:60004-1-Ig)、羊抗兔IgG二抗(proteintech公司,批號:SA00001-2)、羊抗鼠IgG二抗(proteintech公司,批號:SA00001-1);MAP-2單抗(Abcam公司,批號:ab96378);其余試劑均為國產分析純。JJ124BC電子分析天平(常熟市雙杰測試儀器廠),XR-6C小鼠轉棒式疲勞儀(上海欣軟信息科技有限公司),TOPO 220呼吸麻醉機(美國Kent公司),BioSpec 70/20USR小動物磁共振成像儀(德國Bruker公司),RM2016輪轉式切片機(德國Leica公司),JB-P5組織包埋機(武漢俊杰電子有限公司),JK-6生物組織攤烤片機(武漢俊杰電子有限公司),BX53生物顯微鏡(奧林巴斯株式會社),HI650臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司),DYCZ-40G轉印電泳儀(北京六一儀器廠),ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(美國Bio-rad公司),EnSpire?多模式微孔板檢測儀(美國PerkinElmer公司)。

1.4實驗方法 取10只大鼠作為假手術組,其余大鼠參考改良的Longa線栓法[12]制備大腦中動脈栓塞局灶性腦缺血再灌注模型。具體方法:術前12 h禁食不禁水,室溫環境下,大鼠經10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰臥位固定,頸部備皮消毒后沿正中切開約4 cm,逐層鈍性分離出右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈,結扎頸總動脈和頸外動脈的近心端,微動脈夾暫時夾閉遠心端頸內動脈血流,用手術剪在頸外動脈近頸總動脈分叉1 cm處剪一斜細切口,移去頸內動脈動脈夾,將帶有圓形尖端的6-0尼龍絲線經頸外動脈殘端向顱內頸內動脈方向緩緩推進18～20 mm,微感阻力即停止。此時提示栓線已穿過較細的大腦中動脈起始部阻斷了血流,結扎切口固定線栓,消毒逐層縫合,待缺血2 h后緩慢拔出線栓恢復再灌注。大鼠手術蘇醒后出現明顯偏癱癥狀、身體傾斜、爬行旋轉等視為造模成功。假手術組僅動脈分離,不進行線栓處理,余操作同上。將造模成功后的SD大鼠隨機分為模型組、尼莫地平組、天珠散低劑量組、天珠散中劑量組、天珠散高劑量組,每組16只。于造模12 h后,按照文獻[13]計算給藥量,尼莫地平組給予尼莫地平(溶于蒸餾水中)20 mg/kg灌胃,天珠散低、中、高劑量組分別給予天珠散(溶于蒸餾水中)300 mg/kg、600 mg/kg、1 200 mg/kg灌胃,假手術組和模型組給予蒸餾水灌胃,灌胃量均為10 mL/kg,均1次/d,連續10 d。

1.5檢測指標及方法

1.5.1神經功能缺損程度 參照Longa評分法(評分范圍0～5分)[14]分別于灌胃第1天、第3天、第5天、第7天、第10天(當天灌胃后2 h)對各組大鼠進行神經功能缺損程度評估。0分:活動正常,無神經缺損表現;1分:損傷對側前肢不能完全伸展;2分:損傷對側前肢呈蜷曲態,輕度轉圈;3分:行走時向損傷對側傾倒;4分:無自發行走,意識模糊;5分:死亡。排除0分和5分的大鼠,評分越高代表神經功能缺損越重。

1.5.2運動和共濟水平 采用轉棒實驗(檢測嚙齒類動物運動功能的簡便方法,正常大鼠可在旋轉加速的橫桿上不斷行走,而腦缺血大鼠因神經功能缺損則會墜落[15])評估各組大鼠的運動和共濟水平。大鼠適應性訓練3 d后進行正式測試:各組隨機選取5只大鼠,分別于灌胃第1天、第3天、第5天、第7天、第10天(當天灌胃后2 h)置于轉棒疲勞儀的旋轉桿上,5個隔室中同時各放1只,接通電源,設定轉速30 r/min,轉動時間1 min,中途間隔休息10 s,連續測定5次,記錄大鼠從開始轉動至墜落時在轉棒桿上的停留時間。

1.5.3腦梗死體積 采用MRI掃描和TTC染色測定各組大鼠腦梗死體積。

1.5.3.1MRI掃描 末次灌胃2 h后,各組隨機取1只大鼠,吸入3%異氟烷麻醉后,仰臥位固定于掃描床,送入單通道大鼠線圈中心,利用7.0T動物磁共振成像儀行T2加權成像(T2WI)動態檢測腦缺血梗死損傷情況。實驗中保持異氟烷接入大鼠呼吸面罩中,并實時監測其呼吸頻率。參考文獻[16-17]設置T2WI掃描參數:采用快速自旋回波序列,回波時間(TE)=12 ms,重復時間(TR)=2 000 ms,重復1次,反轉角(FA)=180°,矩陣(Matrix)=256×256,視野(FOV)=2 cm×2 cm,層厚1 mm,層數10。掃描完成將MRI數據導入Para Vision 5.1工作站處理。

1.5.3.2TTC染色 末次灌胃2 h后,各組隨機取5只大鼠,予以10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,立即斷頭取腦,置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min。切除嗅球、小腦及低位腦干,于視交叉冠狀面連續切分5張2 mm厚的腦片。將切片輕放入2%TTC染色液中,37 ℃避光孵育15 min,不時用鑷子翻動使切片充分接觸染色均勻。再以4%多聚甲醛溶液固定24 h,取出濾紙吸干并拍照。正常腦組織線粒體內琥珀酸脫氫酶與TTC反應呈鮮紅色,而腦缺血梗死部位因脫氫酶活性缺失不能反應呈蒼白色。應用Image J軟件測定每層切片腦梗死面積,計算各組大鼠腦梗死體積比。腦梗死體積比=(S1+S2+……+Sn)H/(S1’+S2’+……+Sn’)H×100%,Sn為每層梗死區面積,Sn’為每層腦片面積,H為層厚。

1.5.4腦組織HE染色病理形態 末次灌胃2 h后,各組隨機取3只大鼠,予以10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,立即斷頭取腦,PBS緩沖液清洗2次,4%多聚甲醛溶液4 ℃下繼續固定24 h。固定后的腦組織經梯度濃度乙醇脫水、石蠟包埋、切片(厚4μm)及脫蠟后,即行HE染色(蘇木素染液5～7 min、伊紅染液2 min)。切片脫水透明,風干后中性樹膠封片,置于顯微鏡下觀察。

1.5.5腦組織中Wnt3a和MAP-2蛋白表達情況采用 Western blot法檢測:末次灌胃2 h后,各組隨機取5只大鼠,予以10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,立即斷頭取腦置于液氮罐中速凍,-80 ℃冰箱備存。剪取約0.1 g腦組織樣品研磨,加入RIPA進行冰上組織裂解及PMSF勻漿提取總蛋白,并于4 ℃下12 000 r/min離心5 min,BCA法對其上清進行蛋白定量。將提取的蛋白上清與蛋白上樣緩沖液(5×)金屬浴5 min變性,取25 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離,并轉印至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入Wnt3a和MAP-2一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,TBST洗膜(3×10 min),再將PVDF膜放入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔及羊抗鼠IgG二抗(1∶5 000)中,室溫搖床孵育1 h,同樣TBST洗膜(3×10 min),ELC化學發光液曝光顯影,凝膠成像系統觀察拍照。應用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內參計算目標蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1各組大鼠Longa評分比較 假手術組大鼠均評0分;各造模組大鼠均出現神經功能損傷,各組間灌胃第1天、第3天的Longa評分比較差異均無統計學意義(P均>0.05),但隨時間的延長,各組Longa評分呈下降趨勢;其中尼莫地平組灌胃第5天、第7天、第10天的Longa評分,天珠散高劑量組灌胃第7天、第10天的Longa評分和天珠散中劑量組灌胃第10天的Longa評分均明顯低于同期模型組(P均<0.05),而天珠散低劑量組各時間點的Longa評分與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05);各給藥組間比較,僅天珠散低劑量組灌胃第10天的Longa評分明顯高于尼莫地平組(P<0.05)。見表1。

表1 腦缺血再灌注各組大鼠神經功能Longa評分分)

2.2各組大鼠轉棒停留時間比較 模型組大鼠各時間點的轉棒停留時間均明顯短于假手術組(P均<0.05);尼莫地平組和天珠散高劑量組大鼠灌胃第3天、第5天、第7天、第10天的轉棒停留時間和天珠散中劑量組灌胃第5天、第7天、第10天的轉棒停留時間均明顯長于同期模型組(P均<0.05),天珠散低劑量組大鼠各時間點轉棒停留時間與模型組比較呈上升趨勢但差異無統計學意義(P均>0.05);各給藥組間比較,僅天珠散低劑量組灌胃第3天的轉棒停留時間明顯短于尼莫地平組(P<0.05)。見表2。

表2 假手術組和腦缺血再灌注各組大鼠轉棒停留時間比較

2.3各組大鼠腦梗死體積比較 MRI掃描顯示,假手術組大鼠T2WI成像無異常高信號影,余各組大鼠則呈現不同程度范圍的異常高信號影成像,見圖1。TTC染色顯示,假手術組大鼠無白色梗死組織;模型組大鼠見明顯白色梗死組織,腦梗死體積比為(25.24±4.07)%;尼莫地平組和天珠散低、中、高劑量組大鼠腦梗死體積比分別為(14.23±4.58)%、(24.13±3.29)%、(17.97±5.33)%、(14.13±5.79)%,除天珠散低劑量組,其余各給藥組的腦梗死體積比均明顯低于模型組(P均<0.05),尼莫地平組大鼠腦梗死體積比明顯低于天珠散低劑量組(P<0.05),與天珠散中、高劑量組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖2。

圖1 假手術組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織MRI成像情況

圖2 假手術組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織TTC染色情況

2.4各組大鼠腦組織病理學形態比較 假手術組海馬CA1區錐體細胞排列整齊緊密,層次較多,皮質神經元形態正常,胞核居中,核仁清晰,胞漿豐富,分布密集,未見明顯神經細胞炎性浸潤或壞死;模型組缺血側海馬CA1區錐體細胞排列稀疏紊亂,皮質出現水腫和壞死,神經元腫脹或萎縮脫失,空泡樣改變,胞膜輪廓不清,胞體皺縮,胞核深染;各給藥組缺血側腦組織病理形態學變化較模型組有所減輕,神經細胞排列規則,空泡樣變和壞死數相對減少,核仁完整,其中尼莫地平組和天珠散高劑量組改善更明顯。見圖3。

圖3 假手術組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織HE染色表現(×200)

2.5各組大鼠腦組織中Wnt3a和MAP-2蛋白表達情況比較 與假手術組比較,模型組大鼠腦組織中Wnt3a蛋白相對表達量明顯升高(P<0.05),MAP-2蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,各給藥組大鼠腦組織中Wnt3a蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05),MAP-2蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05);尼莫地平組大鼠腦組織中Wnt3a和MAP-2蛋白相對表達量較天珠散低、中劑量組變化更明顯(P均<0.05),僅天珠散高劑量組大鼠腦組織中Wnt3a蛋白相對表達量與尼莫地平組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 假手術組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織中Wnt3a和MAP-2蛋白表達情況

3 討 論

中醫學將腦卒中歸屬于“中風”,認為“風、火、痰、瘀、虛”導致的本虛標實是其主要病機,肝腎陰虛、氣血衰少等“本虛”極易引起氣血津液運行不暢,以致血瘀、痰毒等“標實”互生,由此毒邪侵襲,腦絡受損累及神明[18-19]。傳統中藥防治腦卒中積累了豐富實踐經驗,20世紀80年代湖北恩施地區中藥資源普查發掘出散在民間的天珠散,《土家醫方劑學》謂之為“神衰癥風痰型而設”,具有鮮明的地域性、民族性[20]。處方中的頭頂一顆珠被譽為“神農架四大瑰寶”,極具道地性,乃治療頭痛眩暈之圣藥,具有鎮靜安神、抗腫瘤、抗炎鎮痛和改善腦缺血等藥理作用[21-22];另一配伍天麻息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡,具有鎮靜、鎮痛、抗驚厥、改善記憶、神經保護及增強免疫等藥理作用[23]。土家民族醫學對腦中風“玍毒內生,腦筋不用”病機的獨特理解與中醫經典理論實則契合,天珠散通過祛風散痰、解毒通絡達到腦府得養、神明自復的功效。

本研究借鑒經典Longa線栓法復制大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,采用神經功能缺失評分評估亞急性期(數小時至數天)神經功能缺損程度,結果顯示造模后大鼠出現明顯神經功能損傷,但隨時間的延長,各組大鼠Longa評分呈下降恢復趨勢,說明在動物腦梗死后期有自發性好轉傾向,這可能由于嚙齒類動物自身神經再生修復性強,部分皮質區血液重新分配和代償,使處于缺血半暗帶的腦組織代謝和功能得到局部恢復[24]。另外天珠散高劑量組灌胃第7天、第10天的Longa評分和天珠散中劑量組灌胃第10天的Longa評分均明顯低于同期模型組,說明一定劑量的天珠散能夠促進腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能恢復。

運動障礙是腦卒中最常見的后遺癥之一,因此行為學測試中設置轉棒實驗評估大鼠的運動和共濟水平。本實驗結果顯示,天珠散能不同程度延長腦缺血再灌注損傷大鼠的轉棒停留時間,從宏觀行為學上表明天珠散具有保護神經功能作用。

歐洲卒中組織(ESO)發布的《急性缺血性腦卒中靜脈溶栓指南(2021版)》中強調指出高級腦成像(顱腦MRI或CTP)為癥狀診斷發作或醒后卒中是否啟用阿替普酶靜脈溶栓治療的重要依據[25]。本研究結合高空間分辨率的MRI動態影像和TTC染色結果顯示天珠散能有效降低腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積,客觀表明天珠散可抗腦缺血再灌注損傷。中樞神經系統中的灰質主要由神經元的胞體樹突組成,主導神經中樞的高級功能如語言、思維、運動等;白質由神經元髓鞘包圍的軸突組成,負責大腦的神經傳導系統;海馬則是腦內參與記憶貯存功能的重要部分,與認知關系密切;肢體癱瘓、言語不清、認知障礙等癥狀均與這些部位腦缺血損傷息息相關。本研究HE染色結果從微觀病理學上表明天珠散能減輕缺血腦組織的病理損傷。

Wnt信號是中樞神經系統發育和成熟過程中重要的調控信號通路之一,腫瘤、心腦血管疾病、衰老等諸多疾病的病理生理機制都與此信號轉導相關。Wnt信號轉導模式有經典Wnt/β-catenin、平面細胞極性(PCP)和Wnt/Ca2+3種途徑,而神經干細胞的生長、增殖分化主要由經典Wnt/β-catenin途徑調控,其影響涉及神經元突觸結構、神經血管單元重塑和維持血腦屏障穩態等過程[6]。通路啟動因子Wnt蛋白包含Wnt1和Wnt5a兩個亞族,Wnt3a則是激活經典途徑配體Wnt1家族重要成員[26]。當Wnt信號激活時,Wnt配體蛋白與跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled)及低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP5/6)結合,通過募集胞質中的散亂蛋白(Dishevelled)拮抗糖原合成酶激酶3β、APC和Axin蛋白形成降解復合物(GSK-3β/APC/Axin)以此阻斷β-catenin磷酸化降解,胞質中聚集的游離β-catenin進入核內與轉錄因子家族(TCF/LEF)結合,特異性啟動下游靶基因轉錄及表達的調控[6,27]。MAP-2作為神經細胞骨架成分,既是一種結構蛋白又是功能蛋白,主要在神經元胞體、樹突和突觸后致密區表達,其在神經元發育過程中發揮著穩定結構、調節樹突生長和突觸可塑性等重要功能[28],決定著修復腦缺血再灌注損傷的神經發生作用。目前研究發現Wnt信號與骨形成蛋白在神經分化過程中發揮重要協同作用,Wnt3a蛋白不同活性時神經干細胞增殖分化則表現不同,當Wnt3a活性下調時,神經干細胞的增殖和血小板源生長因子(PDGFR)標記陽性的少突膠質細胞分化被抑制,轉向MAP-2標記陽性的神經元和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)標記陽性的星形膠質細胞分化[29]。活化的星形膠質細胞通過攝取谷氨酸、清除氧自由基和分泌神經營養因子等方式保護神經元[30]。本實驗結果顯示,Wnt信號在大腦中動脈缺血再灌注損傷刺激下介導Wnt3a蛋白應激性高表達,同時誘導缺損神經元MAP-2蛋白表達降低,神經元細胞骨架遭破壞,軸突條索斷裂,軸漿轉運功能下降;天珠散干預后Wnt3a蛋白表達降低而MAP-2蛋白表達增加,說明其通過調節Wnt3a與MAP-2蛋白表達影響Wnt信號轉導,繼而調控神經干細胞的增殖分化和突觸重構。

綜上所述,天珠散能降低腦缺血再灌注大鼠Longa評分和腦梗死體積,延長轉棒停留時間,促進運動功能恢復并減輕缺血腦組織的病理損傷程度,整體發揮抗腦缺血再灌注神經功能缺損的作用,其機制可能與調控Wnt信號轉導關鍵效應分子Wnt3a及MAP-2蛋白的表達,促進神經干細胞對神經元和星形膠質細胞的增殖分化,穩定神經細胞骨架結構改善突觸功能重塑有關。但除Wnt/β-catenin信號通路外,諸如PI3K/Akt、AMPK、NF-κB、Notch/Nrf2等其他信號轉導也參與調控腦缺血再灌注損傷病理生理過程中的能量代謝、細胞焦亡、信號傳遞及神經炎性[31],天珠散促進腦缺血再灌注損傷后神經保護尚需多機制、多靶點切入研究。同時,行為學測試僅根據評分量表和肢體運動的簡單反射觀察,難以全面反映腦缺血大鼠在運動、感覺、情感等方面的缺失,建立基于中醫證候下模擬卒中因素的高血壓、糖尿病等品系動物復合模型及綜合評價體系可能更具臨床指導性。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。