復方降糖玉液調節JAK2/STAT3/SOCS-1通路對糖尿病腎損傷大鼠的保護作用研究

古麗努爾·艾尼,劉春麗,王彥娥

(新疆醫科大學第一附屬醫院,新疆 烏魯木齊 830054)

糖尿病腎損傷是糖尿病進展過程中常見的并發癥,臨床以腎小球濾過率降低及蛋白尿為主要特征,隨著疾病進展會發展成為腎衰竭,危及患者生命。目前研究認為,糖尿病腎損傷的發生發展與糖代謝異常、腎臟血流動力學改變、腎組織氧化應激損傷、腎臟中異位脂肪沉積等多種因素有關[1-3]。酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)/信號傳導及轉錄激活因子3(STAT3)/細胞因子信號抑制物1(SOCS-1)通路是近年來研究發現的與糖尿病腎損傷密切相關的信號通路[4],調節該通路及相關蛋白的異常表達能夠顯著修復糖尿病大鼠腎組織損傷[5]。復方降糖玉液是基于中醫理論由多種中藥材組成的中藥成方制劑,臨床用于糖尿病及其并發癥的治療療效較好。本研究通過動物實驗觀察了復方降糖玉液對糖尿病腎損傷的修復作用及對JAK2/STAT3/SOCS-1通路的影響,旨在明確其藥理作用,為其臨床應用提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性SD大鼠72只,6～8周齡,體重200～220 g,購自新疆醫科大學實驗動物中心,實驗動物許可證號:SCXK(新)2018-0002。飼養環境溫度22～25 ℃,相對濕度40%～70%,晝夜交替12 h,自由飲食。

1.2設備與儀器 CKX41-F32FL熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司);SpectraMax iD5酶標儀(美谷分子儀器有限公司);S700石蠟切片機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);BK-280全自動生化分析儀(山東博科生物產業有限公司);STX622電子天平(奧豪斯國際貿易有限公司);Gel Doc EZ凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司);M16RS高速冷凍離心機(上海邁皋科學儀器有限公司)。

1.3藥品及試劑 復方降糖玉液(新疆醫科大學第一附屬醫院制劑,由黃芪15 g、生曬參10 g、制首烏10 g、黃精15 g、生地20 g、三七10 g、天花粉15 g組成,批號:11120021);厄貝沙坦(海正輝瑞制藥有限公司,批號:CA161,規格:150 mg/片);高糖高脂飼料(北京博泰宏達生物技術有限公司,貨號:1012);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司,貨號:P4812);白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(上海酶研生物科技有限公司,貨號:EK-R36877);單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)ELISA試劑盒(上海繼和生物科技有限公司,貨號:JH-H10542);JAK2(貨號:ab108596)、p-JAK2(貨號:ab32101)、STAT3(貨號:ab68153)、p-STAT3(貨號:ab267373)、SOCS-1(貨號:ab280886)、GAPDH(貨號:ab181602)兔單克隆抗體(艾博抗貿易有限公司),辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(艾博抗貿易有限公司,貨號:ab150077);二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(貨號:PC0020)、TUNEL試劑盒(貨號:T2130)、HE染色試劑盒(貨號:G1120)、磷酸鹽緩沖液(貨號:P1031)(北京索萊寶科技有限公司);蛋白酶K(碧云天生物科技有限公司,貨號:ST533);含DAPI抗熒光淬滅封片液(碧云天生物科技有限公司,貨號:P0131)。

1.4實驗方法 隨機取12只大鼠作為空白組,其余60只大鼠參考文獻[6-7]方法建立糖尿病腎損傷模型:采用高糖高脂飼料喂養8周后,大鼠禁食12 h,一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg,大鼠繼續喂養7 d,采尾靜脈血測定血糖(采血前大鼠禁食6 h),以血糖≥7 mmol/L視為糖尿病模型建立成功,繼續喂養4周并收集24 h尿液,測定尿蛋白量,以空腹血糖≥16.7 mmol/L同時24 h尿蛋白量≥30 mg/24 h視為糖尿病腎損傷造模成功。將造模成功大鼠隨機分為模型組、厄貝沙坦及復方降糖玉液低、中、高劑量組,每組12只。復方降糖玉液低、中、高劑量組按照成人給藥劑量的6.25倍計算,分別給予2.5 g/kg、5 g/kg、10 g/kg(以生藥含量計)復方降糖玉液灌胃,厄貝沙坦組參考文獻[8-9]給予厄貝沙坦0.02 g/kg灌胃,空白組及模型組給予生理鹽水灌胃,均 1次/d,連續8周。

1.5檢測指標及方法

1.5.124 h尿蛋白定量及空腹血糖 末次灌胃后,收集各組大鼠24 h尿液,測定24 h尿蛋白定量。末次灌胃后24 h,禁食6 h,尾靜脈取血,血糖儀測定空腹血糖水平。

1.5.2糖化血紅蛋白及腎功能指標 大鼠稱重后,采用10%水合氯醛麻醉大鼠,腹主動脈取血至干凈離心管,全自動生化分析儀測定糖化血紅蛋白、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平。

1.5.3腎指數及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量 處死大鼠,取腎組織并稱重,計算腎指數,腎指數=腎質量(mg)/體重(g)×100%。取腎組織,研磨勻漿后離心取上清,使用相應試劑盒測定TNF-α、IL-1β、MCP-1含量。

1.5.4腎組織病理形態 分離腎組織,制成5 μm石蠟切片,常規HE染色,置于顯微鏡下進行病理學觀察。

1.5.5腎組織細胞凋亡情況 取制備好的5 μm石蠟切片,使用二甲苯脫蠟后,梯度乙醇至水,滴加20 μg/mL的蛋白酶K抗原修復后,磷酸鹽緩沖液清洗3次,滴加50 μL的TUNEL染色液,37 ℃條件下避光孵育60 min,再次使用磷酸鹽緩沖液清洗3次,滴加含有DAPI的抗熒光淬滅劑,蓋上蓋玻片,置于熒光顯微鏡下進行觀察拍照。細胞凋亡率=TUNEL 陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.5.6腎組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及SOCS-1蛋白表達情況 取腎組織,研磨勻漿后離心取上清,試劑盒測定蛋白含量并取含有50 μg蛋白的上清液,經電泳分離、轉膜及脫脂牛奶封閉后,用GAPDH、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1兔抗體按照1∶1 000稀釋后4 ℃孵育過夜,TBST清洗并用山羊抗兔二抗在室溫下按照1∶2 000稀釋后孵育1 h,使用化學發光液在凝膠成像系統拍照,以GAPDH為內參,Image J 1.8.0計算JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1蛋白相對表達量。

1.6統計學方法 所有數據使用SPSS 26.0軟件進行分析處理,計量資料呈正態分布,結果以均數±標準差的形式表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較使用LSD檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組大鼠血糖及腎功能指標比較 模型組大鼠24 h尿蛋白定量、空腹血糖、糖化血紅蛋白、BUN、SCr水平均明顯高于空白組(P均<0.05);復方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠24 h尿蛋白定量、空腹血糖、糖化血紅蛋白、BUN、SCr水平均明顯低于模型組,且上述各指標均隨復方降糖玉液劑量的增加而逐漸降低,差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠血糖及腎功能指標比較

2.2各組大鼠腎指數及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量比較 模型組大鼠腎指數及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量均明顯高于空白組(P均<0.05);復方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠腎指數及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量均明顯低于模型組,且上述各指標均隨復方降糖玉液劑量的增加而逐漸降低,差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎指數及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量比較

2.3各組大鼠腎組織病理學形態 空白組大鼠腎組織病理形態正常;模型組大鼠腎組織有明顯炎癥細胞浸潤,細胞排列不整齊,腎小管擴張;與模型組比較,復方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠腎組織炎癥浸潤減輕,細胞排列整齊,腎小管無明顯擴張。見圖1。

圖1 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎組織病理學HE染色表現(×200)

2.4各組大鼠腎組織細胞凋亡情況比較 空白組大鼠腎組織細胞無明顯凋亡;模型組大鼠腎組織細胞出現大量凋亡,凋亡率明顯高于空白組(P<0.05);復方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠腎組織細胞凋亡減少,細胞凋亡率均明顯低于模型組,且細胞凋亡率隨著復方降糖玉液劑量的增加而逐漸降低,差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖2及圖3。

圖2 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎組織細胞凋亡染色情況(×200)

圖3 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎組織細胞凋亡率

2.5各組大鼠腎組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1蛋白表達情況 與空白組比較,模型組大鼠腎組織中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值均明顯升高(P均<0.05),腎組織中 SOCS-1蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,復方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠腎組織中p-JAK2/ JAK2、p-STAT3/STAT3比值均明顯降低,腎組織中 SOCS-1蛋白相對表達量均明顯升高,且上述各指標均隨復方降糖玉液劑量的增加變化更明顯,差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖4。

圖4 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1蛋白表達情況

3 討 論

糖尿病腎損傷是由于糖尿病患者長期血糖控制不良引起的腎組織病變,目前以對癥治療為主,其中厄貝沙坦因具有降壓、調節腎臟血流及保護腎細胞作用而被廣泛用于高血壓合并2型糖尿病腎損傷的治療,所以本實驗將其作為陽性對照藥物。但現有的治療手段均不能改變糖尿病腎損傷最終進展為終末期腎病的結局[10],所以研發糖尿病腎損傷的治療藥物尤為迫切。

中醫理論認為,糖尿病腎損傷主要是由于脾腎虧虛,濁毒內蘊,進而導致腎絡瘀結,腎用失司,腎陰虧虛,津液不足,脈絡虧虛,澀滯成瘀,所以中醫認為糖尿病腎損傷的治療應以益氣活血、扶正化瘀為主[11-12]。復方降糖玉液方中以黃芪、生曬參、制首烏補肝腎,益精血,起到補氣固表之功效;以黃精補氣養陰,健脾益腎;生地清熱涼血、養陰生津;三七散瘀止血,消腫定痛;天花粉生津止渴;全方使陽升而陰應,進而起到益氣補血、滋陰補腎之功效。本實驗研究表明,復方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠24 h尿蛋白定量、空腹血糖、糖化血紅蛋白、BUN、SCr、腎指數、腎組織細胞凋亡率均明顯低于模型組,腎組織炎癥浸潤明顯減輕,且各項指標隨著復方降糖玉液劑量的增加變化更明顯。提示復方降糖玉液可呈劑量依賴性地減輕蛋白尿,控制血糖水平,保護腎功能,減輕腎損傷,抑制腎組織細胞凋亡。

近年來研究表明,糖尿病腎損傷的發生及進展與JAK2/STAT3通路激活及炎癥反應有關,TNF-α、IL-1β、MCP-1與腎組織的炎癥反應有關,JAK2/STAT3/SOCS-1通路活化會導致TNF-α、IL-1β、MCP-1水平異常升高,進而導致大鼠腎組織炎癥損傷的發生及進展[13];而下調腎組織中p-JAK2、p-STAT3表達,上調SOCS-1表達可減輕糖尿病腎損傷[13-15]。Porro等[16]研究證實,升高SOCS-1水平能夠顯著降低JAK/STAT通路相關蛋白水平,進而顯著抑制炎癥反應并促進抗炎因子的釋放,進而抑制組織損傷。Morelli 等[17]研究表明,升高SOCS-1水平則能夠通過抑制JAK/STAT通路的激活,進而有效降低IFN-γ及IL-22等炎癥因子對組織器官的過度刺激作用,抑制炎癥反應的發生。由此可見,調節JAK2/STAT3/SOCS-1通路及相關蛋白的表達水平可能是治療糖尿病腎損傷的有效途徑。本實驗研究發現,模型組大鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/ STAT3比值均明顯升高,腎組織中 SOCS-1蛋白相對表達量明顯降低;與模型組比較,復方降糖玉液各組大鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量和p-JAK2/ JAK2、p-STAT3/ STAT3比值均明顯降低,腎組織中 SOCS-1蛋白相對表達量均明顯升高。提示復方降糖玉液能夠呈劑量依賴性地抑制JAK2/STAT3/SOCS-1通路激活,下調TNF-α、IL-1β、MCP-1水平,從而減輕腎組織炎癥損傷,保護腎組織細胞。

綜上所述,復方降糖玉液能夠明顯降低糖尿病腎損傷大鼠的尿蛋白和血糖,保護腎功能,抑制腎組織細胞凋亡,減輕腎組織損傷,其機制可能與調節JAK2/STAT3/SOCS-1通路,抑制TNF-α、IL-1β、MCP-1表達,減輕炎癥反應有關。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。