一種基于NanoBiT 互補以發現SARS-CoV-2 S 蛋白與ACE2 結合抑制劑的高通量篩選方法

張志恒，劉建喜

（南通大學 特種醫學研究院，江蘇 南通 226019）

由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 型感染引起的新冠感染（CoronaVirus Disease 2019，簡稱SARS-CoV-2），給世界各地的醫療服務和經濟發展帶來了困擾[1-2]。目前，新型冠狀病毒感染肺炎已納入我國傳染病防治法規定的乙類傳染病，世衛組織也宣布新冠疫情不再構成“國際關注的突發公共衛生事件”。但數據表明，65 歲以上人群，特別是男性，新冠感染后還有可能出現嚴重的癥狀[3]。再者，輝瑞公司注冊的新冠病毒治療藥物奈瑪特韋片/利托那韋片組合包裝（即Paxlovid）價格昂貴，難以普及。因此，還需研發治療新冠感染的新型藥物。已有研究確認，ACE2 是SARS-CoV 的功能性受體[4]，SARS-CoV-2 RBD 和ACE2 結合模式與SARS-CoV RBD 幾乎相同[5]。因此，一個備受關注的治療靶點是SARS-CoV-2 刺突蛋白與宿主受體ACE2 之間的相互作用[6]，本文主要圍繞ACE2 和RBD 設計實驗方案展開研究。

藥物再利用是為已批準或正在研究的藥物確定新用途的過程，與新藥發現過程相比，因其大大節約了時間和成本，而被視作一種非常有效的藥物發現策略。包括植物提取物在內的傳統中藥具有潛在的抗冠狀病毒能力，可用于治療藥物的開發[7-12]。因此，本文高通量篩選的化合物庫包括自然活性化合物庫和FDA 批準的藥物庫，其中一些化合物是中藥材中的有效成分，以期為中藥用于治療新冠感染提供有益探索。

目前，對于發現SARS-CoV-2 的抗病毒藥物的高通量篩選方法很多，包括虛擬篩選[13-14]、熒光共振能量轉移（FRET）[15-16]、GFP 互補分裂方法[17]、基于ELISA 的高通量篩選[18]等。生物發光反應廣泛用于高通量篩選，NanoLuc（NLuc）作為一種新型生物發光平臺，與其他熒光素酶發光體系相比，具備更好的酶學穩定性、更小的分子量和更強的發光強度。此外，NLuc 的底物表現出更高的穩定性和更低的背景活性。因此，本文擬運用NLuc 發光系統開發新的高通量篩選方法，以發現SARSCoV-2 RBD 和ACE2 互作的抑制劑。

1 實驗方法

1.1 化合物庫

本研究中用于高通量篩選SARS-CoV-2 RBD 和ACE2 相互作用抑制劑的化合物庫是FDA 批準的藥物庫（Targetmol 公司）和天然生物活性化合物庫（Targetmol 公司）。化合物溶解于DMSO，濃度為10 mM，保存溫度-80 ℃。

1.2 實驗細胞

健康的人胚胎腎細胞HEK 293 購于Obio 公司，其細胞狀態與培養條件都符合實驗基本要求。

1.3 主要儀器和試劑

儀器：普通PCR 儀（Life Technology 公司）、瓊脂糖凝膠電泳系統（六一公司）、電泳儀和轉膜儀全套（Bio-Rad Laboratories 公司）、CO2細胞恒溫培養箱（Thermo 公司）、核酸蛋白定量檢測儀（Eppendorf 公司）、激光共聚焦顯微鏡SP8（Leica公司）、色紅外激光成像系統（ODYSSEY 公司）、自動移液工作站（Apricot 公司）、多功能酶標儀（Tecan公司）、化學發光凝膠成像系統（Bio-Rad 公司）。

1.4 方法

1）細胞模型制備。DNA 片段RBD、ACE2、SmBiT 和LgBiT 由Genecreate 公司合成。在50 μL體系中用100 ng DNA 片段進行PCR 擴增，退火條件為60 ℃、20 s，延伸條件為72 ℃、10 s。在1 %瓊脂糖凝膠中電泳，恒壓150 V，22 min。在化學發光凝膠成像儀紫外照射下將目的片段切下并用MonarchDNA Gel Extraction Kit 回收DNA 片段。將載體pLVX-IRES-hyg 用XhoI 和XbaI 雙酶切，100 μL 體系中各2 μL 酶，37 ℃，2 h。將目的片段與載體連接，10 μL 體系中加入2 μL DNA片段和1 μL 載體，50 ℃，15 min。在50 μL 感受態細胞中加入2 μL 連接產物，冰浴30 min 后42 ℃水浴熱激40 s，用玻璃三腳架均勻涂抹在LB 固體培養基中，倒置于30 ℃培養箱內12～16 h。出現單菌落時用槍尖挑單克隆菌置入2 mL LB 液體培養基中，在搖床上培養，條件為30 ℃，220 r/min，12～16 h。用快速質粒DNA 小量提取試劑盒提取目標質粒后，進行酶切鑒定并送Genecreate 公司測序，確保序列正確。將目標質粒對應的菌進行大量培養，根據需求用高純度質粒小提中量提取試劑盒或無內毒素質粒中量提取試劑盒進行大量提取質粒。將目標質粒轉染HEK 293 細胞，將質粒與Lipofectamine 2000 以1∶3 比例混合均勻，靜置20 min 后加入細胞培養基Opti-MEM 中，6 h 后換成完全培養基。

2）細胞免疫熒光。在12 孔細胞培養板中加入細胞爬片，每孔加入500 μL PDL 進行包被，用dd H2O 清洗后晾干。將轉染24 h 后的細胞消化后鋪至12 孔細胞培養板。第二天用PBS 將細胞清洗三次，搖床最慢速，每次3 min，再用4 %PFA 固定細胞，固定20 min，吸掉PFA，用PBS 清洗3 次，每次3 min，用1 % BSA 室溫封閉2 h，將1 % BSA 吸出，加入配好的一抗，保持4 ℃過夜。第二天在室溫復溫1 h，細胞用PBS 在搖床上清洗3 次，每次清洗3 min，用0.01 M PBS 稀釋二抗，在室溫避光孵育2 h，用PBS 在搖床上清洗3 次，每次清洗3 min，避光，將細胞晾干，將載玻片從培養板中取出，蓋玻片上加入封片劑，將載玻片反扣在蓋玻片上。晾干后，在共聚焦顯微鏡下拍片。

3）蛋白質印跡。將轉染24 h 后的細胞用預冷的PBS 洗2 遍，加入200 μL 配制好的裂解液，用細胞刮從皿底刮下細胞后，吸入1.5 mL EP 管中，冰浴30 min，14 000 r/min、20 min、4 ℃離心，將上清液吸至1.5 mL EP 管。蛋白定量后，確定每孔蛋白上樣量為30 μg，配制蛋白上樣體系后，100 ℃，5 min，進行蛋白變性。配制10 %下層分離膠和5 %上層濃縮膠，加樣，開始電泳，恒壓80 V，把電流調到最大，待marker 分開后電壓調到110 V，待溴酚藍到分離膠的底部時停止電泳。根據目的蛋白的分子量對照marker 的條帶切割需要的部分，浸泡在轉膜液中。PVDF 膜在甲醇中激活2 min，按照負極→多孔濾墊→濾紙→凝膠→PVDF 膜→濾紙→多孔濾墊→正極的順序進行轉膜，恒流300 mA，90 min。用5 %脫脂奶粉或者5 % BSA 在搖床上封閉2 h，用5 %脫脂奶粉或者5 % BSA稀釋抗體，4 ℃孵育一抗過夜。第二天將膜從冰箱中取出，室溫放置1 h，回收抗體，膜用TBST 緩沖液緩慢搖動洗滌15 min，共洗3 次，用5 %脫脂奶粉或者5%BSA 稀釋二抗，室溫避光孵育2 h，回收抗體，膜用TBST 緩沖液緩慢搖動洗滌15 min，共洗3 次，使用Odyssey 紅外成像機器顯影。

4）優化藥物篩選條件。將轉染RBD-SmBiT和LgBiT-ACE2 24 h 和48 h 的細胞上清收集起來，分別用DMEM 稀釋2 倍、4 倍、8 倍、16 倍和32倍，每孔加入10 μL RBD-SmBiT 和10 μL LgBiTACE2，離心。將5 μL 含有0%、0.25%、0.5%、1%等不同濃度DMSO 的DMEM 加到孔中以構成25 μL 體系，離心。加入25 μL Nano-GloHiBiT Extracellular Detection System 檢測試劑。離心，用Tecan Spark 多功能酶標儀讀板。熒光檢測時間分別為加檢測試劑后1 min、5 min、10 min、15 min。

5）篩藥流程。用移液工作站在384 孔板每孔中加入10 μL 稀釋的RBD-SmBiT。將5 μL 100 μM的化合物加入板中，混合并離心到孔底。將板在室溫下放置30 min，以使化合物與RBD 完全結合。A2-D2 為0.5 % DMSO，M23-P23 為100 nM 未標記的RBD。加入10 μL 稀釋的LgBiT-ACE2，混合并離心。所有板在室溫下放置30 min。每孔加入25 μL Nano 熒光檢測試劑，混勻，離心。室溫孵育10～20 min 后，讀板。

1.5 統計學分析

使用GraphPad Prism（version 8.01）進行數據統計分析和繪圖。計算Z′因子，公式為Z′=1-，其中：σ 為標準差，μ表示平均值，c+是陽性對照，c-是陰性對照。

2 實驗與結果

2.1 實驗設計

NanoBiT 的檢測原理是將熒光素酶亞基LgBiT 和低親和力SmBiT 融合至兩個能夠相互作用的蛋白質末端。推測SmBiT 和LgBiT 間親和力較低，不易互相結合，只有當RBD 和ACE2 結合時，才能將SmBiT 和LgBiT 帶到一起，互補形成功能復合體，使熒光素酶具備活性，此時加入底物將會有熒光。當有理想的小分子化合物阻斷RBD和ACE2 相互作用時，熒光素酶將不具備活性，加入底物將不會有熒光（如圖1），從而可篩選出小分子化合物。

圖1 ACE2/RBD-NanoBiT 檢測設計

圖1 中，ACE2 和RBD 與NanoBiT 融合，三角形部分是SmBiT 的短肽，圓形部分是LgBiT 的長肽，長方形部分分別是RBD 和ACE2。當ACE2和RBD 的相互作用被理想的抑制劑阻斷時，兩個熒光素酶亞基分離，失去酶活性，不會催化底物產生熒光。

2.2 RBD-SmBiT 和LgBiT-ACE2 熒光素酶活性的表達

構建LgBiT-ACE2，SARS-CoV-RBD-SmBiT和SARS-CoV-2-RBD-SmBiT 的過表達質粒，過表達質粒在10 %瓊脂糖凝膠電泳中的成像如圖2。為確定設計的RBD-SmBiT 和LgBiT-ACE2能分泌至細胞培養基中并具有熒光素酶活性，在12 孔板中將少量pLVX-RBD-SmBiT-hyg 和pLVX-LgBiT-ACE2-hyg 轉染HEK 293 細胞。轉染48 小時后，在細胞膜上檢測到少量綠色熒光信號，如圖3a）、b）、c）。

圖2 LgBiT-ACE2，SARS-CoV-RBD-SmBiT和SARS-CoV-2-RBD-SmBiT 過表達質粒

圖3 ACE2/RBD-NanoBiT 的表達

轉染48 h 后分別收集細胞培養基和細胞。用PBS 洗滌細胞兩次以去除培養基中任何可能的分泌熒光素酶。測量20 μL 上清液和20 μL 完全培養基中10 k 細胞的熒光素酶活性。結果表明，RBD-SmBiT 和LgBiT-ACE2 主要分泌至細胞培養基，RLU 為150 k，而在細胞中表達較少，只有37 k RLU，如圖3d）。對于SARS-CoV-2，RLU 值分別為170 k 和40 k，如圖3e）。未轉染的細胞和相應上清液的發光背景為50～200 RLU。

用25 μL 上清液進行進一步免疫印跡實驗，檢測到大小約110 ku 的蛋白質條帶，接近LgBiTACE2 的預期值，如圖3f）。檢測到的大小為35 ku的蛋白質接近于RBD-SmBiT 的預期值，如圖3g）、h）。表明所設計的ACE2/RBD-NanoBiT 實驗滿足進一步測定的要求。

綜上可知：圖3 中a）—c）顯示在轉染48 h后細胞表面檢測到少量LgBiT-ACE2 和RBDSmBiT；d）、e）表明LgBiT-ACE2 和RBD-SmBiT主要分泌到細胞培養基中；f）—h）表明細胞表達的LgBiT-ACE2 和RBD-SmBiT 的分子量接近預期大小。

2.3 ACE2/RBD-NanoBiT 檢測的優化

用于篩選數千種化合物的高通量篩選分析方法需要廣泛優化和評估，以驗證分析其性能是否滿足要求。RBD-SmBiT 和LgBiT-ACE2 的小樣本實驗經過熒光素酶測試后，用慢病毒轉導的HEK 293細胞產生了大量的RBD-SmBiT 和LgBiT-ACE2。

首先，對RBD-SmBiT 和LgBiT-ACE2 進行稀釋倍數的優化。純化的RBD-SmBiT 和LgBiTACE2 分別稀釋2、4、8、16 和32 倍，熒光素酶的信號最高達1000 k RLU 左右，見圖4a）。根據發光值確定RBD-SmBiT 稀釋4 倍，LgBiT-ACE2 稀釋2 倍。

圖4 ACE2/RBD-NanoBiT 檢測的優化

圖4 中，a）為優化RBD-SmBiT 和LgBiTACE2 的稀釋倍數。將純化的蛋白質分別稀釋2，4，8，16 和32 倍，然后以1 ∶1 的體積比加入檢測試劑，試劑添加1，5，10，15 min 后收集信號；b）為優化DMSO 濃度。將稀釋的RBD-SmBiT、LgBiT-ACE2 與0，0.25 %，0.5 %，1 % DMSO 混合后加至384 孔板，再加入檢測試劑，1，5，10，15 min 后測量發光值；c）為在稀釋好的RBDSmBiT、LgBiT-ACE2 和0.5 % DMSO 體系中，測量未標記RBD 的IC50。

其次，優化反應體系中合適的DMSO 濃度。將2 倍稀釋的LgBiT-ACE2 和4 倍稀釋的RBDSmBiT 與0 %，0.25 %，0.5 %，1 % DMSO 混合，加至384 孔板內檢測。結果表明，0.5 % DMSO 既使化合物保持良好溶解，又能保持酶活性不受明顯影響，見圖4b）。

最后，為了驗證酶的特異性，在2 倍稀釋的LgBiT-ACE2、4 倍稀釋的RBD-SmBiT 和0.5 %DMSO 體系中，用未標記的RBD 在384 孔板中進行評估。未標記RBD 的IC50為47.95 nM，如圖4c）。結果表明，所建立的ACE2/RBD-NanoBiT 檢測適用于高通量篩選以發現ACE2 和RBD 互作的抑制劑。

2.4 采用ACE2/RBD-NanoBiT 方法高通量篩選藥物

在優化測定關鍵條件后，將小型的預實驗轉為以384 孔板的格式進行藥物篩選。原始化合物庫以384 孔格式購買，濃度為10 mM。子化合物庫用含2.5 % DMSO 的DMEM 稀釋為100 μM。在第3 列和第22 列之間測試了化合物。詳細過程見圖5。

圖5 SARS-CoV-2 RBD 與ACE2 互作抑制劑的高通量篩選過程

圖5 中：a）用移液工作站在384 孔板每孔中加入10 μL 稀釋的RBD-SmBiT；b）將5 μL 100 μM的化合物加入板中，混合并離心到孔底，將實驗板在室溫下放置30 min，以使化合物與RBD 完全結合，A2-D2 為0.5 % DMSO，M23-P23 為100 nM未標記的RBD；c）加入10 μL 稀釋的LgBiTACE2，混合并離心；d）所有實驗板在室溫下放置30 min；e）每孔加入25 μL 檢測試劑，混勻，離心；f）室溫孵育10～20 min 后，讀板。

使用優化的ACE2/RBD-NanoBiT 測定法共篩選6 400 種化合物，其中10 塊板藥物來自FDA批準的藥物庫，另外10 塊來自天然生物活性化合物庫。每板設置4 孔陽性對照（100 nM 未標記的RBD）和陰性對照（0.5 % DMSO）進行質量控制。對照實驗顯示，陰性和陽性對照間產生了較大的分離帶，HTS Z′=0.7。結果證明了該方法的可靠性，見圖6a）。所有數據點都用對應實驗板中的陰性對照進行歸一化處理，散點分布如圖6b）所示。

圖6 ACE2/RBD-NanoBiT 檢測的評估

圖6a）為每塊板設置4 孔陽性對照（100 nM未標記的RBD）和4 孔陰性對照（0.5 % DMSO），共篩選了20 塊化合物板所繪制的散點圖。由圖6b）可見，共測試了6 400 種化合物，多數是不影響RBD 和ACE2 的沉默化合物，樣品值與對照值的比值在1 左右，比值小于0.5 的化合物被認為具有抑制作用。

3 結論

本文所開發的NanoBiT 互補方法對蛋白—蛋白相互作用具有更加突出的準確性，小蛋白標簽對目的蛋白構象干擾小。大多數實驗室可開展類似實驗，對一些化合物進行小批量蛋白互作抑制劑活性分析。該測定法具有靈敏度高、速度快、信號強、成本可控等優點，檢測相對簡單、經濟，也可用于高通量篩選，具有一定的普遍適應性。

NLuc 能很好地應用于高通量篩選受體或蛋白相互作用的激動劑和抑制劑。如使用NLuc作為報告基因來檢測細胞膜上受體內在化的情況[19]，利用NLuc 熒光素酶高通量篩選抗體[20]。NLuc 可以分成HiBiT 和LgBiT 兩個亞基[21]，或SmBiT 和LgBiT兩個亞基。其區別是，HiBiT 與LgBiT 的親和力比SmBiT 與LgBiT 的親和力高，前兩者能自發形成NLuc 功能性復合物，而后兩者因較低的親和力，不易自發形成完整的NLuc 熒光素酶。SmBiT 與LgBiT 的結合需要借助外力，當兩個蛋白相互作用時，才能把兩個NLuc 亞基帶到一起，此時距離足夠近，兩個亞基才能互補形成NLuc。

通常在初次高通量篩查中存在許多假陽性命中。在多數情況下，主要命中率約為2 %～3 %[22]。在ACE2/RBD-NanoBiT 分析中，剔除明顯的假陽性命中后[23]，如果將抑制效果為60 %的化合物作為潛在抑制劑，則有136 個（2.12 %）命中，表明命中百分比相對合理。假陰性和假陽性命中可能由多種因素引起，包括但不限于以下原因：第一，與NLuc 結合并抑制NLuc 活性的化合物可能模擬ACE2 和RBD 的抑制劑；第二，激活NLuc 熒光素酶的化合物可以模擬ACE2 和RBD 的激活劑。因此，NLuc 報告基因檢測也有局限性。與螢火蟲熒光素酶不同[24]，目前還沒有NanoLuc 抑制劑的參考資料。但是這種情況可以通過采用類似策略的平行篩選來避免。因此使用ACE2/RBD-NanoBiT和Mpro-NanoBiT 兩種NanoBiT 的檢測方法，一方面是對SARS-CoV-2 多靶點的篩選，另一方面是采用平行篩選來排除假陽性。

下一步將對篩選到的潛在抑制劑進行抗病毒有效性驗證。將用新冠病毒假病毒（義翹）侵染hACE2 表達的HEK 293 細胞驗證小分子的抗病毒有效性[25]。當確定抗病毒活性后，在給藥與不給藥的條件下，利用病毒感染小鼠肺組織，并通過組織切片來評估化合物抑制SARS-CoV-2 病毒侵染小鼠肺上皮細胞的能力，評估藥物對SARSCoV-2 誘導肺損傷的療效，并檢測給藥后小鼠體重、肺損傷和致死率。