獼猴桃根際土壤可培養細菌分離及潰瘍病拮抗菌篩選

楊 睿,汪琳羅沙,姚 迪,唐蘊哲,張婧一,彭清忠

(吉首大學生物資源與環境科學學院,湖南吉首 416000)

獼猴桃潰瘍病是由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae,Psa)引起的細菌病害,具有發生范圍廣、傳播速度快、致病性強、防治難度大等特點,短期內極易造成大面積樹體死亡[1]。目前,采用抗生素(如鏈霉素、春日霉素)和銅制劑(如銅氧化物、銅氫氧化物)的化學防治是主要防控措施,但該方法極易引起Psa的耐藥性,并且使用后抗生素和重金屬殘留污染環境[2-5]。生物防治是環境友好型植物健康管理新方式,具有無污染,無殘留,不殺傷天敵,不易產生抗藥性,利于人畜安全及環境保護,兼防兼治,增產增收等優點,符合人們對綠色食品的需求[6]。因此,利用生物防治法控制獼猴桃潰瘍病更具應用前景。

根際土壤微生物是土壤的重要組分,對于植物健康的意義可以類比為腸道微生物對于人類健康的作用,在肥力演變、物質循環及促進植物生長發育中發揮著重要作用,可直接影響作物產量和質量[7]。在根際土壤微生物中包含許多對植物有益的微生物群落,它們通過相互作用構建植物特殊免疫屏障,能夠抑制病原菌,一定程度防止植物發病[8-10]。從根際土壤中篩選得到的病蟲害拮抗菌,由于直接來源于土壤,作為生物防治劑具有快速適應環境的優勢。基于此,筆者采用擬純培養法從湘西地區獼猴桃植株根際土壤樣品中分離細菌,進行鑒定和微生物多樣性分析,然后利用牛津杯法篩選拮抗Psa的菌株,以期為獼猴桃潰瘍病生物防治劑的研制積累種質資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集以湘西地區3個獼猴桃主要種植區作為采樣點,即保靖縣遷陵鎮(28°07′N,109°57′E),永順縣松柏鎮(28°54′N,110°4′E),鳳凰縣阿拉營鎮(27°54′N,109°22′E)的“米糧1號”和“紅陽”獼猴桃果園,隨機采集2種獼猴桃根際土壤樣品,放入冰盒中帶回實驗室備用。

1.2 培養基配置LB培養基:蛋白胨10 g,NaCl 10 g,酵母膏5 g,水1 000 mL,pH 7.0;高氏一號培養基:可溶性淀粉20.00 g,NaCl 0.50 g,KNO31.00 g,K2HPO40.50 g,MgSO4·7H2O 0.50 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,水1 000 mL,pH 7.0。固體培養基均加入2.0%瓊脂。

1.3 可培養細菌分離將采集的獼猴桃植株根際土壤樣品各稱取5 g,加入至裝有50 mL無菌水的三角瓶中,25 ℃,150 r/min 振蕩0.5 h,使土樣充分分散。然后將土樣稀釋100倍,吸取上清液各200 μL涂布于不同培養基上。放入培養箱28 ℃恒溫培養2～4 d,待培養基上長出單菌落后,記錄細菌數量,挑取形態不同的單菌落,通過四分體劃線純化菌株,利用LB培養基轉接3次,保存菌種。

1.4 基于16S rRNA基因序列的系統發育分析采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株總DNA,利用細菌通用引物PA/PB(PA:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;PB:5′-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′)對分離菌株分別進行16S rDNA序列PCR擴增,反應體系為:TaqPCR Mix (2X) 25 μL;正反引物各1 μL;模板2 μL;無菌水補齊至50 μL。PCR程序為:95 ℃預變性2.5 min;95 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個循環;72 ℃后延伸10 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢驗后,送至生工生物工程(上海)有限公司進行序列測定。將測得的序列送至GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫,采用Blast工具軟件搜索同源序列并進行比較分析,運用Mega 7.0軟件中的鄰位加入法(neighbor joining,NJ)構建系統發育樹,根據同源性和系統發育關系,確定菌株的種類歸屬。

1.5 獼猴桃潰瘍病拮抗菌株篩選供試菌株為從獼猴桃根際土壤中分離得到的細菌,供試靶標菌丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidae,Psa)為實驗室前期分離鑒定的菌株L211。首先將供試菌株種子液按1%接種量加入液體LB培養基25 ℃,150 r/min培養48 h制成發酵液,接著分別利用離心機和冷凍真空干燥儀對上清液進行提取和濃縮備用;取200 μL靶標菌L211發酵液涂布于LB培養基上,在每個平板上放置1個牛津杯,加入200 μL供試菌株濃縮后的發酵上清液,于25 ℃恒溫培養48 h,觀察是否有抑菌圈產生。

2 結果與分析

2.1 可培養細菌的分離采用純培養法從2種獼猴桃根際土壤樣品中分離獲得164株細菌(含放線菌)。從2種培養基的分離情況看,LB培養基分離效果較好,菌落數量和菌落形態較為豐富;高氏一號培養基分離效果相關較差,菌落形成單位低,且菌落顏色單一。綜合分析菌落形態特征,去除部分冗余,最終從164株根際土壤細菌中選取142株代表菌株開展后續試驗。

2.2 根際土壤細菌類群多樣性提取分離菌株基因組DNA,PCR擴增獲得序列長度約1.5 kb的16S rRNA基因片段,經測序和系統進化分析,初步鑒定142株細菌分別屬于4門(Actinobacteria,Bacteroidetes,Firmicutes,Proteobacteria),6綱(Actinomycetia,Alphaproteobacteria,Betaproteobacteria,Gammaproteobacteria,Bacilli,Flavobacteriia),11目(Bacillales,Burkholderiales,Corynebacteriales,Flavobacteriales,Hyphomicrobiales,Micrococcales,Pseudomonadales,Rhodospirillales,Sphingomonadales,Streptomycetales,Xanthomonadales),18科(Azospirillaceae,Bacillaceae,Boseaceae,Burkholderiaceae,Comamonadaceae,Flavobacteriaceae,Microbacteriaceae,Micrococcaceae,Micrococcales,Nocardiaceae,Paenibacillaceae,Pseudomonadaceae,Rhizobiaceae,Sphingomonadaceae,Sporolactobacillaceae,Staphylococcaceae,Streptomycetaceae,Xanthomonadaceae),28屬(Azospirillum,Bacillus,Falsibacillus,Lysinibacillus,Metabacillus,Priestia,Bosea,Burkholderia,Caballeronia,Cupriavidus,Paraburkholderia,Ralstonia,Variovorax,Flavobacterium,Microbacterium,Arthrobacter,Sinomonas,Rhodococcus,Paenibacillus,Pseudomonas,Ensifer,Rhizobium,Novosphingobium,Scopulibacillus,Staphylococcus,Kitasatospora,Streptomyces,Stenotrophomonas)。其中,Firmicutes門菌株為優勢菌群(70株,49.3%),其余依次為Beta-proteobacteria亞門(42株,29.6%)、Actinobacteria門(19株,13.4%)、Alpha-proteobacteria亞門(6株,4.2%)、Gamma-proteobacteria亞門(4株,2.8%)和Bacteroidetes門(1株,0.7%)。在屬水平上優勢屬為Bacillus(62株,43.7%)(表1)。結果表明,獼猴桃根際土壤細菌具有豐富的類群多樣性。

2.3 根際土壤細菌物種和遺傳多樣性根據系統發育分析結果,采用16S rRNA基因序列同源性≥97%可歸為同一種的原則,142株細菌可歸為76個物種。其中,有104株分離菌株與典型菌株16S rRNA基因序列相似性在97.03%～100%,可基本確定其分類地位;有38株細菌與典型菌株16S rRNA基因同源性在92.03%～96.87%,可能為潛在的新種或新屬,分類地位有待進一步確定(表1)。這表明分離菌株與系統發育關系最密切的典型菌株之間存在較大的遺傳差異,具有遺傳多樣性。

表1 獼猴桃根際細菌與其關系最密切典型菌株的系統發育關系Table 1 Phylogenetically closest neighbors of kiwifruit rhizosphere bacteria based on 16S rRNA gene sequence analysis

接下表續表1

接下表續表1

2.4 獼猴桃潰瘍病拮抗菌篩選與鑒定以分離的142株細菌為供試菌株,通過牛津杯試驗初篩,發現4株細菌(菌株編號A11、D1h、A4和B15)的發酵液在牛津杯周圍出現抑菌圈(圖1),說明這4株菌能夠抑制潰瘍病菌Psa的生長,其發酵液中可能存在拮抗Psa生長的代謝產物或降解Psa菌體成分的蛋白酶類。對4株拮抗菌進行系統發育分析,發現菌株A11和D1h與紅球菌屬的Rhodococcusgloberulus(MG575949、EU004416、MK356456、MT555342)聚為一支,其與關系密切典型菌株的16S rRNA基因序列同源性在97.00%以上;A4與芽孢桿菌屬的Bacillusthuring(FJ601902.1) 、Bacilluscereus(HG800012.1) 、Bacillustoyonensis(MG561363.1)、Bacillusacidiproducens(MF446886.1) 、Bacilluswiedmannii(MW435481.1)聚為一支,其16S rRNA基因序列同源性在97.00%以上;B15與鏈霉菌屬的Streptomycestriticiradicis(MN512450)聚為一支,其16S rRNA基因序列同源性在97.00%以上(圖2)。初步確定,菌株A11和D1h屬于紅球菌屬(Rhodococcus),菌株A4屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),B15屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)。

3 討論

該試驗從獼猴桃根際土壤中分離獲得了142株細菌,分別歸屬于細菌域六大系統發育類群(Actinobacteria,bacteroidetes,Firmicutes,Alphaproteobacteria,Betaproteobacteria,Gammaproteobacteria)、11個目、18個科、28個屬、76個物種,其16S rRNA基因序列與關系密切典型菌株相似度在92.03%～100%。可以看出,獼猴桃根際土壤細菌具有豐富的類群、物種和遺傳多樣性,并存在潛在的新種或者新屬類群。其中,細菌優勢類群為Firmicutes門(70株,49.3%),有研究表明,Firmicutes門為土壤的重要免疫細菌,在保護植物免受病原菌侵染中具有重要作用[11]。推測Firmicutes門是獼猴桃預防潰瘍病的主要類群之一。

通過牛津杯試驗,從142株細菌中篩選出4株有拮抗效果的細菌(A11、D1h、A4、B15),經過系統發育分析,確定菌株A11和D1h屬于紅球菌屬,菌株A4屬于芽孢桿菌屬,B15屬于鏈霉菌屬。結果表明,獼猴桃根際土壤中存在拮抗潰瘍病菌的微生物類群。紅球菌是一種具有良好抗菌效果的革蘭氏陽性菌,有研究報道,該類細菌能產生新抗生素[12],如Kurosawa等[13]從紅球菌中分離出紅鏈霉素A和紅鏈霉素B(Rhodostreptomycin)對革蘭氏陰性和陽性菌有良好的抑制活性;Kitagawa等[14-15]從紅球菌中發現了一種新型喹啉類抗生素(aurachin)對表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和痤瘡丙酸桿菌有良好的拮抗效果。芽孢桿菌是一類具有生防潛力的微生物,其可以通過分泌抗生素、細胞壁水解酶以及鐵載體等胞外代謝產物表現出拮抗活性[16-17],杜貞娜等[18-19]報道了拮抗Psa的芽孢桿菌類群。鏈霉菌能夠分泌多種抗生素,是目前抗生素生產應用較廣的一類細菌[20-21],其分泌的鏈霉素是防治Psa的主要殺菌劑[22],朱云海等[23]在獼猴桃組織中發現能拮抗Psa的肉桂地鏈霉菌。由此可見,筆者篩選的紅球菌(2株)、芽孢桿菌及鏈霉菌可能是生物防治獼猴桃潰瘍病的優良菌株,其拮抗機理有待進一步發掘。

綜上所述,獼猴桃根際土壤中可培養細菌具有豐富的類群、物種和遺傳多樣性,并存在拮抗潰瘍病菌的微生物類群。該研究發現了拮抗Psa的紅球菌屬細菌,為獼猴桃潰瘍病生物防治劑的研制積累了種質資源。