野生生境青刺果根際土壤細菌群落結構多樣性分析

鄭 鵬,張 玥

(1.麗江師范高等專科學校,云南麗江 674100;2.滇西北高原特色農業研究中心,云南麗江 674100)

健康的土壤是維持土壤生態系統服務功能的關鍵,一個具有高生物多樣性的健康土壤一定具有較為優良的理化性質[1]。土壤中蘊藏著巨大微生物多樣性,是聯系大氣圈、水圈、巖石圈及生物圈物質與能量交換的重要紐帶,而每克土壤中,高達99%的物種及其功能尚屬未知[2]。土壤微生物多樣性可以敏感地反映土壤環境的微小變化,能夠監測土壤質量變化,是土壤生態系統的重要生物學指標[3]。研究表明,微生物多樣性越高,土壤將表現出更多的生態功能、病蟲害抵抗力、抗環境脅迫性和更高的作物生產能力[4-6]。

早在1904年,德國學者Hiltner就提出了“根際”一詞,按相關微生物提供的定植生態位特性,可細分為根際(rhizosphere)、根表(rhizoplane)和根系內部(endorhiza),近年來,根際微生物組的巨大潛力在相關的研究中得到證實[7]。了解內生細菌多樣性有助于闡明它們的功能和潛在作用,進而優化植物生長狀態[8]。根際微生物的群落結構、數量變化會直接影響地上植物對營養物質和水分的吸收及植物的抗逆性[9]。植物生長過程中釋放20%～60%的光合產物,如糖、有機酸等進入根際微域,根系分泌物在碳、氮、硫等循環中發揮重要作用,從而改變根系的釋水特性和根際土壤養分濃度,影響根際土壤微生物的活動,進而影響植物的生長[10]。研究表明,植物根系選擇性地招募特定的土壤微生物,如變形桿菌(Proteobacteria)、放線菌(Actinobacteria)等,而微生物特異性富集也取決于植物根際區系、土壤類型、營養狀況和發育階段等因素[11]。

目前,國內外研究集中在從青刺果中分離鑒定單體化合物如L-表兒茶素、β-谷甾醇-β-葡萄糖苷等[12],以及青刺果果實酚類成分和相關抗氧化特性[13-14]等方面;對青刺果根際土壤微生物多樣性相關研究尚未見報道。因此,探究青刺果根際微生物多樣性的影響,對改善青刺果根際土壤菌群結構及促進青刺果生長和土壤肥料的施用具有重要意義。

青刺果(PrinsepiautilisRoyle),是一種較耐旱并與滇西北少數民族共同生活了幾千年的野生植株,也是麗江市政府大力推廣退耕還林的主要樹種。青刺果又名總花扁核木,是薔薇科李亞科扁核木屬植物[15],生長在海拔2 200～2 700 m中國南部和印度的北部[16],全株可以入藥,種子可榨油,是一種天然的高級食用油。目前,高通量測序已被廣泛應用于污水、土壤和深海等復雜環境的微生物多樣性分析中[17]。高通量測序技術不需要分離培養,直接從DNA層面進行種群組成分析,并可提供更加豐富的細菌多樣性相關信息[18],因而,高通量測序已被越來越多地應用于微生物群落結構及群體多樣性分析中。

探究植物根際微生物群落特征及微生物多樣性分析,有助于能夠準確掌握植物根際土壤微生物群落豐度及微生物群落多樣性水平上的變化。筆者以青刺果為研究對象,采用高通量測序技術對青刺果根際與非根際土壤內生細菌菌群豐度、多樣性及潛在功能進行深入全面分析,為全面揭示野生生境青刺果根際與非根際土壤內生細菌群落結構差異、功能菌株的挖掘和對環境條件變化引起的土壤細菌菌落動態變化提供參考,并為今后人工大面積栽培青刺果植株土傳病害、優化植株生長及土壤生態系統奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集2021年1月11日,于云南省麗江市(100°20′E,26°53′N,海拔2 686 m),選擇青刺果子房膨大期采樣,隨機選擇3株,分別采集青刺果根際土壤和非根際土壤,共采取土樣6份帶回實驗室,獲得2組平行樣品(非根際土壤與根際土壤),編號分別為A組、B組。

青刺果根際、非根際土壤采集方法采用吳秋芳等[19]的方法。挖取青刺果植株根系,抖動根部松散系土壤,用消毒的刷子收集粘在青刺果根際的土壤至2 mL離心管中,視為青刺果根際土壤樣品;而非根際土壤為距離青刺果根系表面5～10 cm范圍內5～20 cm的土壤;裝入無菌袋中,過100目篩,于-80 ℃中保存。

1.2 土壤樣品基因組DNA提取及16S rRNA擴增測序土壤樣品微生物群落DNA提取采用NucleoSpin Soil kit(Macherey-Nagel,Germany)試劑盒;用qubit?dsDNA BR(Invitrogen,USA)及 qubit?熒光計,檢測其濃度和純度。測序靶標DNA為16S rRNA基因V3～V4可變區,所用引物為341F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′)和806R(5′ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)。正反向引物標記有Illumina adapter序列。取質量合格的基因組DNA樣品30 ng及對應的融合引物配制PCR反應體系(50 uL)。PCR反應條件:94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,56 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,30個循環,72 ℃延伸10 min。使用Agencourt AMPure XP磁珠對PCR擴增產物進行純化并溶于Elution Buffer,貼上標簽,完成建庫。使用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫的片段范圍及濃度進行檢測。檢測合格的文庫根據插入片段大小,選擇HiSeq平臺進行測序。以上工作由華大基因科技有限公司(武漢分公司)完成。

1.3 數據分析將能匹配到引物的reads,用軟件cutadapt v2.6截取掉引物和接頭污染,得到目標區域片段;采用按窗口去低質量的方法:設置25 bp為窗口長度,如果窗口平均質量值低于20,從窗口開始截除read末端序列,移除最終read長度低于原始read長度75%的read。去除含N的reads;去除低復雜度的reads(連續10個ATCG),最終得到Cleandata。序列拼接使用軟件FLASH(Fast length Adjustment of short reads,V1.2.11),質控指標(最小匹配長度15 bp;重疊區域允許錯配率為0.1)利用重疊關系將雙末端測序得到的成對reads組裝成一條序列,得到高變區的Tags。利用軟件USEARCH(v7.0.1090_i86linux32)將拼接好的Tags按照97%序列相似性聚類生成OTU。得到OTU代表序列后,通過RDP classifer(1.9.1)軟件將OTU代表序列與數據庫比對進行物種注釋,置信度閾值設置為0.6,對注釋結果進行如下過濾:去除沒有注釋結果的OTU;去除注釋結果不屬于分析項目中的物種。最終采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學分析,并在界門綱目科屬種水平統計各樣本的群落組成。

2 結果與分析

2.1 土壤細菌高通量測序結果青刺果非根際土壤樣本測序共獲得148 148×2條,質控后得到139 238條高質量的clean reads,拼接為75 960條Tag;根際土壤樣本測序共獲得221 696×2條,質控后得到208 306條高質量的clean reads,拼接為118 738條Tag。由表1可知,按照97%序列相似性聚類生成OTU,非根際土壤樣本共獲得4 102個OTU;根際土壤樣本共獲得6 197個OTU。

2.2 根際與非根際土壤樣品細菌菌群的α多樣性分析由表1可知,從Coverage指數來看,數值都在94%以上,說明本次測序結果代表了樣本的真實情況和樣本物種的多樣性,基本能反映樣品細菌群落結構組成,數據可靠。樣品B中Shannon指數、Chao指數、ACE指數都高于樣本A組,反映出B組樣品細菌數量、物種數和均勻度高于A組;simpson指數表明A組細菌多樣性高于B組,且兩組樣品差異不顯著。

表1 不同樣品OTU值和α多樣性指數Table 1 OTU and alpha diversity index of different samples

韋恩圖可以展示多樣品共有和特有的OTU數目,可直觀展示樣品間OTU的重疊情況,從而可以反映出樣品間相似性和重疊情況。從韋恩圖(圖1)可以看出,青刺果非根際土壤細菌菌群與根際土壤細菌菌群共有的OTU數量為2 201個;A組(非根際土壤)特有的OTU數為98個;B組(根際土壤)特有的OTU數為184個。B組特有的OTU值明顯多于A組,表明青刺果根際土壤細菌菌群豐度大于非根際土壤細菌菌群豐度。

圖1 青刺果非根際、根際土壤細菌菌群OTU韋恩分布Fig.1 Venn diagram of OTU distribution of bacterial flora in rhizosphere and nonrhizosphere soil from Prinsepia utilis Royle

2.3 青刺果土壤細菌群落組成及差異分析

2.3.1基于門水平上的非根際與根際土壤細菌群落組成比較。在門分類水平上,青刺果非根際與根際土壤細菌歸類到11個門(圖2)。其中非根際土壤細菌相對豐度大于1%的門有8個,分別為Actinobacteria(放線菌門)、Nitrospirae(硝化螺旋菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Gemmatimonadetes(芽單孢菌門)、Cyanobacteria(藍細菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門),分別占土壤細菌總序列的12.8%、1.2%、33.8%、27.1%、4%、3.1%、1.1%和4.5%。根際土壤細菌相對豐度大于1%的門也有8個,分別為Actinobacteria(放線菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Gemmatimonadetes(芽單孢菌門)、Cyanobacteria(藍細菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Candidatus_Saccharibacteria,分別占土壤細菌總序列的14.4%、34.4%、22.5%、3.4%、2.2%、7%、4.8%和1.2%。A組與B組共有的菌門,豐度占比最大的是Proteobacteria(變形菌門),分別占非根際、根際土壤內生細菌總序列的33.8%、34.4%;其次是Acidobacteria(酸桿菌門),分別占27.1%、22.5%;Actinobacteria(放線菌門)分別占12.8%、14.4%。另外,A組中Cyanobacteria(藍藻細菌門)1.1%豐度明顯低于B組7%;Nitrospirae(硝化螺旋菌門)在A組中豐度>1%,而B組中豐度<1%;Candidatus_Saccharibacteria在B組中豐度>1%,而A組中豐度<1%。;A組和B組其他菌門無顯著差異。

2.3.2基于綱水平上的非根際與根際土壤細菌群落組成比較。由圖3可知,在綱分類水平上,按照豐度>1%,青刺果根際與非根際土壤內生細菌共有10個優勢菌綱:Cytophagia(噬纖維菌綱)、Acidobacteria(酸桿菌綱)、Anaerolineae(厭氧繩菌綱)、Alphaproteobacteria(α-變形菌綱)、Betaproteobacteria(β-變形菌綱)、Gemmatimonadetes(芽單孢菌綱)、Actinobacteria(放線菌綱)、Sphingobacteriia(鞘脂桿菌綱)、Gammaproteobacteria(γ-變形桿菌綱)、Deltaproteobacteria(δ-變形菌綱)。其中,B組特有的菌綱為Deinococci(異常球菌綱)、Elusimicrobia、Fibrobacteria(纖維桿菌綱),但其相對豐度<0.1%。A組特有的菌綱為Negativicutes(厭氧菌綱),相對豐度<0.1%。

圖3 綱分類水平上細菌菌落豐度分布Fig.3 Abundance of bacterial community at the class level

2.3.3基于屬水平上的非根際與根際土壤細菌的菌群結構組成。在屬分類水平上,青刺果根際土壤細菌與非根際土壤細菌共有110個屬,相對豐度位居前30的土壤細菌菌群組分分析結果顯示(圖4),A組中相對豐度大于1%的青刺果非根際土壤細菌有9個屬:Gp6(13.6%)、消化螺菌屬Nitrospira(1.2%)、Aridibacter(1.2%)、Gpl(1.1%)、鞘脂單孢菌屬Sphingomonas(2.6%)、Gp4(4.9%)、Gp16(1.5%)、Gp3(1.8%)、芽單孢菌屬Gemmatimonas(3.1%);B組中相對豐度大于1%的青刺果根際土壤細菌有13個屬:Gp6(11.5%)、新鞘脂菌屬Novosphingobium(1.0%)、Saccharibacteria(1.2%)、Chryseolinea(1.1%)、節桿菌屬Arthrobater(1.3%)、Gpl(7.0%)、鞘脂單孢菌屬Sphingomonas(2.2%)、Gp4(4.3%)、Gp16(1.0%)、Gp10(1.0%)、Gp3(1.2%)、芽單孢菌屬Gemmatimonas(2.2%)、鏈霉菌屬Streptomyces(1.6%)。其中,A組與B組中細菌豐度占比最高的是Gp6,分別占13.6%、11.5%。以上結果顯示,青刺果非根際土壤細菌與根際土壤細菌優勢菌屬組成非常相似,除B組中Gpl(7.0%)豐度值高于A組Gpl(1.1%)外,其他菌屬在青刺果非根際與根際土壤細菌菌群豐度差異不顯著。

2.3.4樣品間細菌LEfSe聚類分析。LEfSe聚類樹分析,是一種用于發現和解釋高緯度數據生物標識的分析工具,可以實現分組之間的比較,從而了解不同組之間微生物菌群在豐度上有顯著差異的物種(biomaker)。青刺果土壤細菌樣品A組與B組LEfSe聚類分析結果顯示(圖5),與B組相比,A組中Negativicutes(LDA 4.432,P值0.036 9<0.05)、selenomonadales(LDA 4.432,P值0.036 9<0.05)、鞘氨醇單孢菌屬Sphingomonas(LDA 3.873,P值0.049 5<0.05)為起到重要作用的微生物類群,豐度上存在顯著差異。其余綠色著色差異物種Biomarker為B組中起到重要作用的細菌類群,其豐度與A組相比也有顯著差異(P<0.05)。著色黃色的為無顯著差異細菌類群。

2.3.5青刺果根際與非根際土壤微生物功能基因預測分析。基于KEGG數據庫進行了功能預測(圖6),在一級功能層面共獲得6類生物代謝功能,為遺傳信息處理(genetic information processing)、人類疾病(human diseases)、代謝(metabolism)、有機系統(organismal systems)、環境信息處理(environmental information processing)和細胞過程(cellular processes)。其中,遺傳信息處理、代謝和細胞過程是一級功能中重要的部分,分別占11.4%、82.0%、3.6%。

在二級功能層面進行預測基因分析(圖7),發現該細菌菌落主要涉及到輔助因子和維生素的代謝(metabolism of cofactors and vitamins)、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝(Metabolism of terpenoids and polyketides)、細胞運動(cell motility)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、脂質代謝(Lipid metabolism)和信號轉導機制(signal transduction)等27個功能。

圖7 基于KEGG數據庫二級功能層預測結果Fig.7 Predicted results of secondary function layer based on KEGG database

3 討論

青刺果是我國寶貴的民族野生油料作物資源,也是麗江市政府大力推廣的退耕還林重要樹種。青刺果耐寒、耐旱能力強,全株可入藥,具有極高的開發和利用價值,特別是對高血壓、高血脂、心腦血管疾病等都有很好的預防效果;青刺果油富含維生素且脂肪酸組成與人體脂肪酸的構成相似,利于人體的吸收和利用,是一種高級食用油[20-21]。青刺果一直以來是滇西北少數民族地區重要的油料經濟作物,麗江納西族人民食用及外用青刺果尖、果已經有幾千年的歷史,但目前對青刺果植株種植技術、肥料施用技術、微生物多樣性等研究方面還存在空白。因此,開展野生青刺果土壤微生物研究意義重大,可為今后青刺果土壤生態系統改良、優化植物生長狀態、施肥和病蟲害防控等提供重要參考。

該研究首次利用高通量測序對野生生境青刺果非根際與根際土壤細菌16S rRNA基因序列進行分析,從青刺果非根際土壤樣本共獲得4 102個OTU;根際土壤樣本共獲得6 197個OTU。通過α多樣性分析,并結合維恩圖進行分析,發現青刺果根際土壤細菌菌群豐度大于非根際土壤細菌菌群豐度,這與以往研究結果相似[22-23]。其原因主要是,根際土壤中養分高于非根際土壤,植物根系不斷向土壤中分泌大量的有機物質,從而形成“根際沉積”,這些“根際沉積”作為聯系植物、土壤、微生物的橋梁,發揮著非常重要的作用,為根際微生物的活動提供了豐富的營養物質,而土壤微生物可借助趨化感應,向含有根系分泌物的根表面進行活動[24],因此,“根際沉積”影響了根際微生物群落的結構與功能,該沉積過程,也造成了植物根際與無植物土壤在物理、化學等特性的差異[25]。當然,土壤類型也是影響根際微生物群落原始結構重要因素之一,不同類型的土壤決定了根際微生物區系最初的狀態,研究表明,土壤類型是影響根際細菌和菌根真菌群落結構最重要的因素[26]。土壤中的細菌也可以通過植物開放性結構進入植物組織細胞內,并能夠促使其形成具有生態功能的群落[27]。

該研究結果也顯示,在門分類水平上,青刺果非根際與根際土壤細菌歸類到11個門。優勢菌門為Actinobacteria(放線菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)。其中,Proteobacteria(變形菌門)豐度最高,這與許多研究類似。王橋美等[28]研究普洱地區茶葉根際土壤細菌中豐度較高的是變形菌門(Proteobacteria),張玲豫等[29]研究河西走廊沙地蘆葦根際土壤微生物群落中,變形菌門(Proteobacteria)在4種沙地類型中的相對豐度最高,吳秋芳等[19]研究北艾根際與非根際土壤微生物多樣性中,從細菌組成分析,2種土壤細菌的優勢門均為變形菌門(Proteobacteria)。此外,除在土壤中變形菌門(Proteobacteria)為優勢菌門外,變形菌門(Proteobacteria)在植物體內也存在優勢。楊多等[30]研究表明胡楊葉片優勢菌群為變形菌門(Proteobacteria),藍柏成等[31]研究降香黃檀內生細菌的群落結構及多樣性,其心材優勢菌為變形菌門和藍細菌門。 該研究結果發現,在門分類水平上,青刺果根際與非根際土壤細菌菌群豐度具有差異性,但差異不顯著。在綱分類水平上,青刺果根際與非根際土壤內生細菌共有10個優勢菌綱;但根際土壤細菌特有的菌綱為Deinococci(異常球菌綱)、Elusimicrobia、Fibrobacteria(纖維桿菌綱);非根際土壤細菌特有的菌綱為Negativicutes(厭氧菌綱),說明植物根系的生長以及從外界環境吸收養分與水分需要氧氣,因此,在根際土壤細菌中尚未檢測到厭氧菌綱。在屬水平上,酸桿菌屬(Acidobacterium)總豐度最高,為優勢屬;其次豐度較高的屬為消化螺菌屬Nitrospira、Aridibacter、鞘脂單孢菌屬Sphingomonas、芽單孢菌屬Gemmatimonas、新鞘脂菌屬Novosphingobium、Saccharibacteria、Chryseolinea、節桿菌屬Arthrobater、鏈霉菌屬Streptomyces。在土壤中,酸桿菌屬細菌是土壤微生物的重要組成成員,數量占細菌總量的20%左右[32],其在土壤物質循環和生態環境的構建中起著非常重要的作用[33]。另外,酸桿菌相對豐度隨海拔呈單峰變化,即低海拔和高海拔多樣性高于中海拔,這與該研究結果基本一致[34]。目前基于16S rDNA序列分析,酸桿菌門細菌被劃分為26個亞群(GP1～GP26),該研究經高通量測序到的酸桿菌亞群有GP1、GP3、GP4、GP6、GP7、GP10、GP16和GP17,其余亞群并未檢測到。同時,該研究還檢測到鏈霉菌屬Streptomyces,豐度也較高,為核心屬;鏈霉菌一直以來都是醫學、藥學等研究的熱點,且多數為非致病菌,該菌株能夠產生抗腫瘤、抗蟲、抗病毒等活性代謝物,是人類開發新藥的重要代謝物來源[35]。

通過LEfSe聚類樹分析,發現A組中起到重要作用的細菌類群biomaker明顯少于B組,說明B組(根際土壤細菌)細菌菌群豐度高于A組(非根際土壤細菌),為極顯著差異。根際土壤細菌與非根際土壤細菌的差異,主要是因為植物通過根系活動改變根際土壤的養分含量和土壤理化性質,從而改變了根際微生物群落組成,根系微生物能夠利用“根際沉積”效應將土壤營養物質分解,轉化為植物可吸收的狀態,促進植物生長同時提高自身的抗逆性,最終導致根際與非根際土壤微生物群落組成和多樣性的差異[36]。此外,微生物群落的活動變化與植物生長發育密切相關,特別是根系有益菌群能夠促進植物根系對氮、磷等營養元素的吸收,從而增強植物對生物及非生物抵御的能力[37]。

該研究進一步對基因功能預測分析,在一級功能層面共獲得6類生物代謝功能,即遺傳信息處理、人類疾病、代謝、有機系統、環境信息處理、細胞過程;在二級功能層面上,主要涉及輔助因子和維生素代謝、碳水化合物代謝、萜類化合物和聚酮類化合物代謝、細胞運動、氨基酸代謝、脂質代謝和信號轉導機制等27個二級功能,以上結構提示人們作為涼拌而食用的青刺果莖尖、用果進行榨油,其植株體內可能含有的微生物會對人類健康存在潛在威脅。同時也提示土壤微生物與植株存在相關物質和能量的交流。值得一提的是,基因功能預測也提示青刺果根際與非根際土壤內生細菌表現出較高的萜類化合物、聚酮類化合物活性物質,這表明青刺果土壤內生細菌在抗菌、抗腫瘤、抗癌等菌株篩選方面值得關注。

綜上,野生生境青刺果根際與非根際土壤細菌的菌群組成及豐度具有一定的差異,青刺果體內同樣也存在多樣的內生細菌,這些青刺果體內內生細菌是否與野生生境青刺果根際土壤存在一定的關聯,還需要進一步研究。此外,通過基因功能預測,發現野生生境下的青刺果根際土壤細菌的代謝物可能對經常食用青刺果嫩葉和青刺果油的納西族人民的健康存在潛在風險,這需要關注。總之,該研究只是針對生長在野生環境條件下青刺果根際與非根際土壤細菌進行了初步研究,對青刺果生長具有促進作用細菌的分離及鑒定將是下一步要開展的工作。