靈芝菌絲水提物活性成分分析研究

孫國強 董金穎 曹發昊

（1 山西瑞芝生物科技有限公司，山西 運城 044000；2 運城學院，山西 運城 044000）

靈芝Ganoderma lucidum，自古就是名貴的藥用真菌[1-2]，含有多糖類、三萜類、甾醇類、核苷類、氨基酸、多肽及多種微量元素，具有調節免疫力、抗腫瘤、抗衰老、保肝、提高機體耐缺氧能力等作用[3-8]。2000 年版《中國藥典》規定，赤芝、紫芝子實體為藥材來源[9]。市場上以靈芝子實體或孢子為原料的保健食品較多，但不管是野生還是人工栽培的靈芝都極易受自然條件限制，產品質量波動大，生產規模遠不能滿足市場需求[10］。近年來，采用發酵技術生產靈芝菌絲，實現了規模化量產，可有效解決以上問題[11]。研究表明，靈芝菌絲與子實體的營養成分十分相似，對人體同樣有藥用作用[12]。

國內外針對靈芝子實體及其孢子的成分、含量研究較多[2，3，6，9-10]，但對靈芝菌絲的相關研究報道卻較少[5-11]，且目前尚無較全面的靈芝菌絲水提物活性成分分析數據，限制了靈芝菌絲水提物活性成分產品開發。因此，筆者較系統地分析研究靈芝菌絲水提物的多糖、三萜、甾醇、靈芝酸、腺苷、氨基酸、微量元素、農藥殘留及黃曲霉毒素的含量，以期為其作為食品新資源提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）靈芝菌絲水提物：靈芝菌絲水提物是由山西瑞芝生物科技有限公司的靈芝深層液態培養物經過濾，水洗得靈芝菌絲，再按料液比1∶8用水煎煮提取2次，混合提取液即得。

（2）主要儀器：UV2550 紫外-可見分光光度計（日本島津株式會社），DK615HTD超聲波清洗器（深圳市得康科技有限公司），Agilent1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），DHG9620A 電熱鼓風恒溫箱（深圳市愛特爾電子科技有限公司），BP211D電子天平（德國賽多利斯集團），AL204電子天平（梅特勒托利多科技中國有限公司），HHS4 數顯恒溫水浴鍋（上海致金儀器設備有限公司），EXPEC510 減壓平行濃縮儀（杭州譜育科技發展有限公司），GILSON GX274 全自動固相萃取儀（美國吉爾森公司），XT-9 900 A 微波消解儀（上海新拓分析儀器科技有限公司），AA220 原子吸收分光光度計（美國瓦里安公司），300MS 氣質聯用儀（美國瓦里安公司），UPLC-TQD液質聯用儀（美國沃特斯公司）。

（3）主要試劑：無水葡萄糖、齊墩果酸、靈芝酸A、D、F、G 和腺苷（均購自中國食品藥品檢定研究院）；硫酸、蒽酮、乙醇、甲醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙腈、甲酸、鹽酸、硝酸、苯酚、無水乙醇、濃硫酸、二水合磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉（均購自國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 多糖、三萜及甾醇測定

多糖測定采用蒽酮-硫酸法，三萜及甾醇測定采用香草醛-高氯酸法，方法依據參考文獻[13]。

1.2.2 靈芝酸及腺苷測定

按文獻[14]方法分析靈芝酸、腺苷。

試樣制備：將靈芝菌絲水提物濃縮干制后，精密稱取粉末1.025 4 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL 溶解，超聲處理40 min，搖勻抽濾，收集濾液，藥渣再次加10 mL 甲醇，超聲處理40 min，抽濾。收集合并兩次濾液，旋干，用色譜級甲醇定容至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得供試品溶液。

對照品溶液的制備：精密稱取靈芝酸A、D、F、G和腺苷各 1.10 mg、1.06 mg、0.95 mg、1.11 mg、1.03 mg 于一離心管中，加入1 mL 色譜級甲醇，超聲溶解，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得對照品溶液。

測定條件：色譜柱為JADE-PAK?ODS-AQ（5 μm，250×4.6 mm），流動相為乙腈（A）：0.1%甲酸水（B）。

表1 梯度洗脫條件

1.2.3 氨基酸組成測定

按文獻[15]方法分析氨基酸組成。

1.2.4 微量元素分析

按文獻[16]第一法電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）分析微量元素。

樣品處理方法：將靈芝菌絲水提物濃縮干制后，稱取0.3 g 樣品，于微波消解罐中，加入5 mL 純硝酸，搖勻，放入微波消解儀中，按微波消解程序進行消解（表2）。消解完成后，將消解罐轉移至電熱板上趕酸，趕酸至近干，加水溶解并轉移至25 mL容量瓶中，定容，搖勻。

表2 微波消解程序

1.2.5 農藥殘留及黃曲霉毒素測定

按文獻[17]2341 農藥殘留量測定法項下第五法藥材及飲片（植物類）中禁用農藥殘留測定法，2351真菌毒素測定法項下黃曲霉毒素測定法，分析33種禁用農藥殘留、黃曲霉毒素。

2 結果與分析

2.1 靈芝菌絲水提物多糖、三萜及甾醇含量

由表3可以看出，靈芝菌絲水提物與子實體、菌絲體一樣含有多糖、三萜及甾醇，質量分數分別為0.43%、0.18%。

表3 靈芝菌絲水提物中多糖、三萜及甾醇含量

2.2 靈芝菌絲水提物靈芝酸及腺苷含量

由表4 可以看出，靈芝菌絲水提取中含有靈芝酸A、D、F、G 以及腺苷，質量分數分別為7.2 μg/g、6.9 μg/g、32.0 μg/g、12.6 μg/g、42.1 μg/g。

表4 靈芝菌絲水提物中靈芝酸及腺苷含量 單位：μg/g

2.3 靈芝菌絲水提物氨基酸及含量

由表5 可以看出，靈芝菌絲水提物中氨基酸種類豐富，含有除色氨酸外的7 種人體必需氨基酸在內的16種常見氨基酸，其中含量較多的氨基酸依次為谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸，質量分數分別為1.88 g/100 g、1.78 g/100 g、1.15 g/100 g，這些氨基酸為其主要氨基酸。靈芝菌絲水提物中氨基酸總量達13.70 g/100 g，必需氨基酸總量、支鏈氨基酸總量和芳香族氨基酸總量分別占氨基酸總量的31.02%、15.77%、8.25%。靈芝菌絲水提物中含有高量支鏈氨基酸和低量芳香族氨基酸，可利用這種特殊的氨基酸模式開發產品[18]。

表5 靈芝菌絲水提物中氨基酸及含量 單位：g/100 g

2.4 靈芝菌絲水提物微量元素含量

由表6 可以看出，靈芝菌絲水提物中含有鉀、鈣、鎂、鐵、錳、鋅、銅等7 種人體必須微量元素在內的12種微量元素，其對細胞生長及機體的正常生長發育等起著重要作用。靈芝菌絲水提物具有高鉀低鈉的特點，其中鉀的含量最多，質量分數高達2 342 mg/kg，還含有豐富的鎂（541 mg/kg）和鈣（193 mg/kg），以及0.15 mg/kg的硒。

表6 靈芝菌絲水提物中微量元素含量 單位：mg/kg

2.5 靈芝菌絲水提物農藥殘留及黃曲霉毒素分析結果

為了確保靈芝菌絲水提物的安全無毒，按照《中國藥典》2020年版四部“0212藥材和飲片檢定通則”檢測甲胺磷、久效磷、磷胺、苯線磷、地蟲硫磷、六六六、滴滴涕、除草醚、殺蟲脒等33種禁用農藥殘留及黃曲霉毒素，詳見表7。

由表7 可以看出，靈芝菌絲水提物的33 種禁用農藥殘留和黃曲霉毒素均未檢出，證實其安全無毒，具備開發成食品新資源的前提條件。

3 小結與討論

靈芝子實體、孢子、菌絲體因含有多種類似的有效成分，如多糖、三萜、氨基酸和微量元素，已被應用于開發藥品、保健食品、特醫食品等[3-8]。當前靈芝正作為一種重要的藥食同源物質按照國家衛生健康委、國家市場監管總局聯合發布的《關于對黨參等9種物質開展按照傳統既是食品又是中藥材的物質管理試點工作的通知》在福建、廣東、廣西、江蘇等十幾個省開展試點工作。

研究結果表明，靈芝菌絲水提物未檢測到33種禁用農藥殘留和黃曲霉毒素，含有0.43%多糖和0.18%三萜及甾醇；靈芝酸A、D、F、G 質量分數分別為7.2 μg/g、6.9 μg/g、32.0 μg/g、12.6 μg/g，腺苷質量分數為42.1 μg/g；含有7 種人體必需氨基酸在內的16 種常見氨基酸，質量分數較高的氨基酸依次為谷氨酸（1.88 g/100 g）、天冬氨酸（1.78 g/100 g）、精氨酸（1.15 g/100 g），氨基酸總量達13.7 g/100 g；含有7 種人體不可缺的微量元素在內的12種微量元素，其中鉀的質量分數高達2 342 mg/kg，含有豐富的鎂（541 mg/kg）和鈣（193 mg/kg），還含有0.15 mg/kg 的硒。靈芝菌絲水提物含有的多種生物活性成分與子實體和菌絲保持一致，表明其能被用于藥品、保健食品、食品等領域，還可作為一種天然營養補充劑。

研究較全面地分析靈芝菌絲水提物的活性成分，為其質量評價提供科學依據，為其進一步開發提供理論支撐，對推動靈芝產業的健康發展具有深遠意義。