兩株秦嶺野生黑木耳菌株分離鑒定及馴化試驗

曹建剛 李存玲 劉 陽 毛儀楠 陳再民 陳鵬博

（陜西省商洛市農業科學研究所，陜西 商洛 726000）

黑木耳又稱木耳、光木耳、云耳、樹耳、木娥等，為擔子菌門、木耳目、木耳科、木耳屬真菌[1]。陜西省商洛市一直將食用菌產業列為脫貧攻堅、鄉村振興的重點特色產業，2022 年以來更是將食用菌產業列為“菌果藥畜茶酒”六大特色產業之首，食用菌作為助推商洛市鄉村振興的“大產業”，發展黑木耳產業是重中之重。商洛市2020年袋栽木耳1.05億袋，干品產量5 270 t，產值5.2 億元；2021 年栽培木耳1.41億袋，干品產量5 600 t，產值5.4億元；2022年栽培木耳1.55 億袋，干品產量7 600 t，產值7.3 億元。商洛市現有規模化木耳生產基地87處，木耳生產大棚3600 個，年產1 000 萬袋以上的菌包生產線7 條，木耳生產企業20 多家，合作社35 個，木耳產業從業人員5 000 多人。以柞水縣、山陽縣、商州縣、鎮安縣為主，輻射全市的木耳產業布局已基本形成，商洛木耳產業得到高質量快速發展，“小木耳”切實做成“大產業”，為商洛市鞏固脫貧攻堅成果與推動鄉村振興戰略全面實施發揮重要作用。

商洛市要做大做強黑木耳產業，推動商洛市木耳產業高質量發展，加快黑木耳種質創新，做強農業“芯片”（黑木耳優良新品種選育）為首要任務。商洛市地處秦嶺腹地，野生黑木耳種質資源豐富，采集馴化黑木耳野生菌株，既可以快速解決商洛市主栽黑木耳品種短缺、依賴外省品種的問題，也可以為黑木耳雜交育種提供有效的種質資源[2]。為此筆者對采自陜西省商洛市丹鳳縣、山陽縣的兩株秦嶺野生黑木耳進行組織分離、分子生物學鑒定及栽培試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）供試菌株：丹鳳野生黑木耳菌株，采自商洛市丹鳳縣巒莊鎮老林溝林場（圖1）；山陽野生黑木耳菌株，采自山陽縣小河口鎮小河口街村山坡；對照菌株為黑威15，商洛市主栽品種，商洛市農科所食用菌研究室保存。

圖1 野生黑木耳（拍攝地丹鳳縣）生態照

（2）供試培養基：①綜合馬鈴薯培養基（PDA）為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，自來水定容至1 000 mL。②原種（栽培種）培養料配方為木屑85%，麩皮12%，白糖1%，石膏1%，石灰1%。料含水量58%～60%。③栽培袋培養料配方為木屑80%，麩皮15%，豆粕3%，石膏1%，石灰1%。料含水量58%～60%。

1.2 試驗方法

1.2.1 子實體形態觀察

取完整子實體部分，觀察并描述其表面性狀、結構、顏色，并進行形態學特征初步鑒定[3]。

1.2.2 野生菌株的組織分離及菌種的制備

取干耳泡24 h，用75%酒精浸泡2～3 min，用無菌水反復清洗干凈后，再用濾紙吸干表面水分，用剪刀將耳片剪成小耳片，用接種針挑取小耳片至PDA 平板，26 ℃培養，待分離組織長出菌絲后純化1～2 次轉入PDA 斜面培養基培養，即可獲得母種。母種接種到原種培養基上發菌后至長滿袋即可獲得原種（栽培種）。

1.2.3 野生黑木耳菌株ITS全序列分析

將丹鳳野生黑木耳菌株、山陽野生黑木耳菌株分別轉管培養，挑選純化、生長健壯的兩株野生黑木耳菌株送往上海生工生物工程股份有限公司進行ITS全序列分析與分子生物學鑒定。

1.2.4 拮抗試驗

將兩株野生黑木耳菌株與對照菌株黑威15 兩兩拮抗培養試驗（26 ℃下黑暗培養），觀察拮抗反應。3次重復。

1.2.5 野生黑木耳菌株菌絲培養特性觀察

1.2.5.1 PDA平板培養菌絲觀察

將供試菌株分別接至PDA 平板（直徑9 cm），26 ℃下黑暗培養，測定菌絲生長速度及記錄長勢。母種菌絲生長速度（cm/d）=菌絲培養皿內直線生長量（cm）/菌絲生長天數（d）。母種（栽培袋）菌絲生長速度采用Microsoft Excel 2021 進行數據處理，采用SAS 8.0進行方差分析和Duncan檢測。

1.2.5.2 原種料袋菌絲生長觀察

將供試菌株母種接種至原種料袋，26 ℃下黑暗培養，每個菌株各15袋。觀察并記錄菌絲長勢及抗雜能力。

1.2.5.3 栽培料袋菌絲生長觀察

將供試菌株原種接種至栽培料袋（塑料袋規格為16 cm×37 cm×0.0036 cm），26 ℃下黑暗培養，每個菌株各100袋。測定菌絲生長速度，記錄長勢、抗雜能力。栽培袋內菌絲生長速度（cm/d）=菌絲生長量（cm）/菌絲滿袋用時（d）。

1.2.6 出耳試驗

栽培袋菌絲滿袋經過后熟，刺孔后移至大棚內地栽出耳。觀察記錄比較各菌株現芽情況、出耳表現，觀察子實體外觀、顏色，統計產量。

2 結果與分析

2.1 兩株秦嶺野生黑木耳菌株ITS全序列分析

采用試劑盒提取基因組DNA，擴增兩株秦嶺野生黑木耳菌株ITS 序列，可發現均有大小約600 bp的單一條帶，測序結果兩株秦嶺野生黑木耳菌株的ITS 序列大小均為576 bp（圖2）。通過BLAST 分析，丹鳳野生黑木耳菌株（Genbank 登錄號SUB13797248）與陜西理工大學Qian X T（2015）發現的黑木耳（KT964887.1）相似性達99.65%，為木耳屬，黑木耳；山陽野生黑木耳菌株（Genbank 登錄號SUB13797271）與西北農林科技大學Yu Z（2008）發現的黑木耳（EU520194.1）相似性達99.83%，為木耳屬，黑木耳。

圖2 兩株野生菌株ITS-PCR瓊脂糖電泳圖

2.2 拮抗試驗結果

由表1可知，丹鳳野生黑木耳菌株、山陽野生黑木耳菌株與對照菌株黑威15均有明顯的拮抗線，丹鳳野生黑木耳菌株與山陽野生黑木耳菌株也有明顯的拮抗線，三者之間互有拮抗反應（圖3），說明他們親緣較遠。

表1 拮抗試驗結果

圖3 供試黑木耳菌株拮抗反應（左為平板正面，右為平板反面）

2.3 不同基質菌絲培養特性觀察結果

由表2 可知，丹鳳野生黑木耳菌株平板培養菌絲潔白、濃密、整齊，山陽野生黑木耳菌株菌絲潔白、絨毛狀、整齊；菌絲生長速度，山陽野生黑木耳菌株與黑威15差異顯著；丹鳳野生黑木耳菌株與山陽野生黑木耳菌株、丹鳳野生黑木耳菌株與黑威15母種菌絲生長速度之間的差異均不顯著。

表2 供試黑木耳菌株平板培養菌絲生長特性

由表3 可知，原種料袋內供試黑木耳菌株菌絲顏色、長勢差異不大，但丹鳳野生黑木耳菌株抗雜能力強，山陽野生黑木耳菌株抗雜能力弱。

表3 供試黑木耳菌株原種培養結果

由表4可知，丹鳳野生黑木耳菌株、黑威15抗雜能力強，山陽野生黑木耳菌株抗雜能力一般（同原種培養結果一致）；山陽野生黑木耳菌株菌絲生長速度顯著快于丹鳳野生黑木耳菌株及黑威15菌株。

表4 供試黑木耳菌株栽培料袋菌絲培養結果

2.4 出耳試驗結果

2.4.1 供試黑木耳菌株催芽結果

供試黑木耳菌株栽培袋菌絲長滿袋經過后熟，刺孔進棚開始集中催芽，催芽時保持溫度15～25 ℃，空氣相對濕度70%～90%，視天氣情況通風，做到“保溫保濕小通風”[4]。

由表5可知，山陽野生黑木耳菌株耳基、耳芽形成快、早，整齊；丹鳳野生黑木耳菌株耳基、耳芽形成快、居中（較山陽野生黑木耳菌株晚3～5 d），較整齊；對照黑威15菌株耳基、耳芽形成慢、晚，較整齊。

表5 供試黑木耳菌株催芽情況

2.4.2 供試黑木耳菌株產量及子實體性狀

由表6可知，丹鳳野生黑木耳菌株單片、耳大耳薄，顏色黃、產量高，抗高溫，少筋或無筋，早熟；山陽野生黑木耳菌株單片、耳中等薄，產量低，不耐大水、高溫，無筋，早熟；黑威15菌株（對照）單片、個大肉厚，產量一般，大筋，中熟（圖4、圖5）。

表6 供試黑木耳菌株產量及子實體性狀

圖4 試驗黑木耳菌株出耳狀態[自左至右為山陽野生菌株、丹鳳野生菌株、黑威15（CK）]

圖5 人工栽培的丹鳳野生黑木耳菌株子實體（左為耳片腹面，右為耳片背面）

山陽野生黑木耳菌株耳片腹面黑褐色，背面瓦灰色（圖6），耳狀，邊緣不規則，無筋，單耳質量（干）0.61 g。

圖6 人工栽培的山陽野生黑木耳菌株子實體（左為耳片腹面，右為耳片背面）

黑威15 菌株耳片腹面黑色，背面深瓦灰色（圖7），耳狀，邊緣規則，大筋，單耳質量（干）1.01 g。

圖7 黑威15菌株子實體（左為耳片腹面，右為耳片背面）

丹鳳野生黑木耳菌株耐高溫，抗逆性強；黑威15 抗逆性較強；山陽野生黑木耳菌株不耐高溫，抗逆性弱。

3 小結與討論

試驗結果表明，采自秦嶺的兩株野生黑木耳菌株經分子生物學鑒定均為木耳屬，黑木耳。袋料栽培結果，丹鳳野生黑木耳菌株比對照黑威15 早熟、產量高、抗雜抗逆性強、耐高溫，有望成為一株性狀優良、適于生產應用的黑木耳菌株，缺點是顏色偏黃；山陽野生黑木耳菌株與對照黑威15 相比，雖產量低、抗雜抗逆性弱、不耐大水和高溫，但其耳芽形成快、早、整齊，早熟，顏色黑，可以用作雜交選育優良菌株親本。