NLRP3/caspase-1途徑在電針聯合高頻重復經顱刺激改善局灶腦梗死大鼠認知和運動功能中的作用

李傳金 姜波 王德利 劉經星 唐小莉

中風(Stroke)一種常見的急性腦血管病,發病率、復發率和死亡率都較高[1,2]。缺血性中風約占所有中風病例的80%。這是由于大腦供血的局部或全身減少,導致缺血或梗死,神經功能喪失或腦卒中[3]。中風導致的腦缺血導致ATP水平降低、乳酸積累和炎癥級聯反應的激活,從而導致腦組織缺血和壞死[4]。腦缺血損傷的臨床治療包括恢復血流和腦再灌注,從而減少中風引起的梗死面積和神經功能缺損。然而,腦再灌注在恢復過程中導致損傷增加,稱為腦缺血再灌注損傷(CIRI)[5]。最近的研究表明,線粒體功能障礙、氨基酸釋放、鈣超載、活性氧(ROS)的產生、氮的形成、環狀RNA(circRNAs)、炎癥和細胞凋亡與CIRI的發病機制有關[6,7]。電針(Electroacupuncture ,EA)具有雙重治療效果,是一種簡單、方便和成本效益高的治療方案,已廣泛用于治療腦缺血后的認知障礙[8,9]。如百會(GV 20)和大椎(GV 14)穴位的電針導致CIRI大鼠大腦皮層的超微結構改變[10];GV 20和神庭(GV24)穴位的EA刺激可以顯著改善MCAO/R誘導的認知缺陷和行為功能障礙[11,13]。研究表明,細胞焦亡在神經認知障礙的形成和發展中發揮重要作用[14]。炎癥體的激活是調控細胞焦亡的經典途徑。NLRP3通過包含CARD的凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)等連接蛋白募集caspase-1,并誘導其前體蛋白酶(pro-caspase-1)發生自水反應。活化的caspase-1可有效觸發下游因子引起細胞焦亡[15,16]。NLRP3作為腦缺血后中樞神經系統無菌性炎性反應的啟動因子,誘導細胞焦亡,導致神經細胞損傷,在腦缺血/再灌注后炎癥級聯效應中起關鍵作用[17,18]。如EA通過α7nAChR介導的NLRP3炎癥小體抑制減輕腦卒中大鼠腦缺血損傷和神經炎癥[19]。另外,介導細胞焦亡的經典caspase-1信號通路在中風后被激活,并加劇腦損傷,而抑制caspase-1激活可減少中風損傷并發揮保護作用[20,21]。本研究的目的是通過NLRP3/caspase-1途徑信號通路研究聯合高頻重復經顱刺激GV20和GV24穴位是否能改善大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusio,MCAO)后的學習和記憶障礙。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 從北京維通利華實驗動物技術有限公司獲得36只無特異性病原體的雄性 Sprague-Dawley 大鼠[10～12周齡,體重(260±20) g]。大鼠在22℃度和濕度50% 的環境中,以12 h/12 h的光照/黑暗周期飼養。對于安樂死,使用2% 的戊巴比妥。將36只大鼠隨機分為假手術組、 MCAO 組和 MCAO + 電針組,每組12只。本實驗獲得十堰市人民醫院動物倫理委員會批準。

1.2 MCAO模型建立 MCAO模型使用Longa方法建立[22]。基于改良的fornylon縫合法,通過頸部切口仔細暴露左側頸總動脈、左側頸外動脈和頸內動脈并解剖。將約18～22 mm的尼龍單絲插入頸內動脈并推進,直至大腦中動脈的起點被阻斷。閉塞120 min后,提取尼龍單絲以恢復血流。對于假手術組,單純分離頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈。在手術期間和之后,使用加熱墊將動物的內部溫度保持在37℃。神經功能缺損評分用于評估MCAO的成功。

1.3 EA治療 MCAO手術后2 h,MCAO+EA組的大鼠使用EA裝置在百會(GV20,位于頂骨中心)和神庭(GV24,位于前中線)穴位接受EA治療。將針刺針以45°角插入頭部GV20和GV24穴位2～3 mm的深度。刺激參數如下:擴張波頻率,1～20 Hz;6 V峰值電壓;2 mA強度,30 min/d,連續8 d。

1.4 神經功能缺損評分 再灌注后2 h和電針治療第8天,使用Longa評分量表評估神經功能[22]:0表示無神經功能缺損,1表示輕度缺損(未能完全伸展右前爪),2表示向右繞圈,3表示向右跌倒,提示中度缺損,4個代表嚴重缺陷(完全喪失行走能力)。得分在1～3表明MCAO建模成功,并被納入后續實驗。

1.5 水迷宮試驗 為了評估學習和記憶能力,如先前的研究方法所述[23,24],在手術后第4天開始使用Morris水迷宮測試大鼠。從第4天到第8天對大鼠進行訓練,并在第9天進行測試。Morris水迷宮測試由兩部分組成:地點導航測試和空間探針測試。水迷宮裝置由直徑150 cm、高度60 cm的圓形水池組成。攝像機記錄并觀察老鼠的活動。在位置導航測試中,大鼠被隨機分配到四個象限中的一個,并被允許找到一個隱藏的平臺。然后,記錄大鼠爬上平臺所需的時間,上限為90 s。如果大鼠在90 s內爬上平臺并停留超過3 s,則認為大鼠找到了平臺,時間記錄為潛伏期。如果大鼠在90 s內無法定位平臺,則將其手動引導至平臺,并讓其在10 s內熟悉平臺位置。對于必須被引導到平臺的大鼠,潛伏期記錄為90 s。每天上午10∶00開始訓練,大鼠每天訓練4次,每次訓練間隔10 min,連續5 d。延遲被記錄為到達平臺所需的時間,并在4次訓練中取平均值。為了進行空間探測測試,在第6天移除隱藏平臺,并測試大鼠記住隱藏平臺位置的能力。讓大鼠自由游泳90 s,并記錄在90 s的試驗中,大鼠游到平臺先前位置的次數。

1.6 2,3,5-三苯基氯化四唑染色 如前研究方法所述[25],使用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物染色在形態學水平上評估腦梗死。簡而言之,在Morris迷宮試驗后,通過心臟向大鼠灌注0.9%氯化鈉溶液,然后迅速取出大腦并在-20℃下冷凍30 min。將腦組織切成5個2 mm冠狀切片,立即在37℃的2%2,3,5-三苯基四氮唑氯化物溶液中培養20 min,然后在黑暗中固定在4%聚甲醛中24 h。用相機拍攝染色部分。計算腦梗死體積百分比。

1.7 透射電子顯微鏡 透射電子顯微鏡用于觀察神經元凋亡和自噬的變化[26]。麻醉后,用3%戊二醛和1.5%多聚甲醛的混合物在4℃下固定皮層缺血周圍區域8 d,然后用1%四氧化鋨在碳酸鈣緩沖液中固定2 h。在室溫下用0.1%磷酸鹽緩沖液洗滌切片。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌后,將樣品用30%～100%乙醇丙酮梯度脫水,加入Epon Araldite 618混合物中2 h,然后切成80 nm的模塊化超薄切片,并用電子顯微鏡觀察。

1.8 Western blot 蛋白質提取以及Western Blot檢驗的相關步驟參考Wang等[27]的方法進行。一抗主要有兔抗β-actin NLRP3、caspase-1(Abcam)。二抗山羊抗兔IgG(Thermo Fisher Scientific,USA)。

1.9 HE染色 腦組織切片分別用二甲苯和無水乙醇脫蠟2次,并水合。清潔后,使用蘇木精染色10 min。用1%鹽酸乙醇進行區分,用1/400氨水進行發藍。清洗后,用伊紅染色5 min。乙醇逐漸脫水。二甲苯透明2次,并用中性樹脂密封。在顯微鏡下觀察海馬神經細胞的形態,以判斷神經細胞損傷的程度。

1.10 免疫熒光 冷凍切片在乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復溶液(Servicebio,China)中煮沸用于抗原提取,并在室溫下用3%牛血清白蛋白封閉30 min。然后,將切片在4℃下與一抗抗caspase-1(和NLRP3的孵育過夜。然后,將切片與相應的二級抗體在室溫下孵育90 min。將切片在PBS中洗滌3次(5 min/次),并使用DAPI對干燥切片染色10 min。通過熒光素(FITC)TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。在顯微鏡下觀察腦組織的形態學變化。隨機選擇海馬CA1區的2個90×視野進行攝影。陽性細胞數按以下公式計算:雙染色細胞/總細胞×100%。

2 結果

2.1 EA減輕局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠的神經功能缺損和梗死體積 在本研究中,神經評分用于評估應用于GV20和GV24穴位的電針是否能改善MCAO后的神經功能。神經評分降低表明神經功能改善。假手術組的大鼠沒有表現出任何神經缺陷的跡象。然而,MCAO后4～8 d,與MCAO組相比,MCAO+EA組的神經評分顯著降低(P<0.05)。使用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物染色測量梗死體積。MCAO組和MCAO+EA組的腦梗死體積顯著大于假手術組,表明MCAO模型成功建立。術后8 d,MCAO+EA組的腦梗死體積相較于與MCAO組顯著減少,表明EA對預防局灶性腦損傷具有顯著療效。見表1、2,圖1。

圖1 EA減輕局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠的神經功能缺損和梗死體積

表1 3組大鼠腦梗死體積的定量結果 %,

表2 EA對腦缺血再灌注損傷大鼠神經評分的影響 只

2.2 EA治療抑制局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠缺血周圍皮質細胞凋亡 在透射電子顯微鏡下,假手術組可以觀察到豐富的線粒體、完整的線粒體嵴、有序的溶酶體和完整的細胞核仁。觀察到大軸突,染色質均勻分布。在MCAO組中,線粒體腫脹,線粒體嵴被破壞,溶酶體出現紊亂,細胞在缺血周圍皮質出現結構紊亂,在神經元細胞核邊緣觀察到常染色質。所有這些觀察結果與早期凋亡信號一致。MCAO+EA組細胞膜部分破裂,線粒體輕度受損。MCAO+EA組未觀察到粗面內質網和染色質的變化,細胞核仁完整,染色質均勻分布。接著探究了EA對局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠缺血周圍皮質NLRP3/caspase-1信號通路的影響。 Western blot分析結果顯示,與假手術組相比,MCAO組缺血周圍皮質中NLRP3、caspase-1的水平顯著升高;與MCAO組相比,MCAO+EA組顯示缺血周圍皮質中NLRP3、caspase-1的水平顯著降低。這些結果表明,EA可以抑制NLRP3/caspase-1信號通路的活性。見圖2,表3。

圖2 EA治療抑制局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠缺血周圍皮質細胞凋亡;A 透射電子顯微鏡細胞形態;B 檢測NLRP3、caspase-1的水平

表3 3組大鼠缺血周圍皮質NLRP3/caspase-1信號通路相關蛋白的檢測結果

2.3 EA對腦缺血/再灌注損傷后海馬神經元損傷的形態學觀察 既往研究表明EA治療對腦缺血/再灌注損傷海馬神經元具有細胞保護作用。HE染色顯示,MCAO組海馬神經元數量減少,排列松散,可見空泡樣改變和不規則的核形態。MCAO+EA組海馬神經元的病理變化減少,神經元變性或壞死減少。TUNEL染色結果顯示,MCAO組中觀察到觀察到大量TUNEL和caspase-1雙染色神經元,MCAO+EA組的TUNEL和caspase-1陽性率顯著降低。此外,MCAO大鼠海馬神經元中caspase-1和NLRP3共定位的表達。EA治療可有效減少MCAO大鼠神經元中caspase-1和NLRP3共定位表達。見圖3,表4。

圖3 EA對腦缺血/再灌注損傷后海馬神經元損傷的形態學觀察;A HE染色;B TUNEL染色

表4 3組大鼠缺血周圍皮質NLRP3/caspase-1信號通路相關蛋白的檢測結果

2.4 EA減輕局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠的學習和記憶損傷 Morris水迷宮試驗用于評估大鼠的認知能力。在位置導航試驗中,MCAO組大鼠的平均潛伏期比假手術組大鼠長。與MCAO組的潛伏期相比,MCAO+EA組的潛伏期顯著降低。在空間探針測試期間,MCAO組穿過目標象限的頻率低于假手術組。然而,與MCAO組相比,MCAO+EA組更頻繁地穿過目標象限。這些結果表明,EA治療顯著改善了MCAO大鼠的學習和記憶能力。見表5、6。

表5 3組大鼠在空間探針試驗中穿過目標象限的次數

表6 EA對局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠位置導航試驗潛伏期的影響

3 討論

大量臨床研究證實,EA刺激穴位可促進中風癥狀和癱瘓肢體功能的恢復,并可顯著改善缺血性中風患者的認知水平和運動功能[28,29]。然而,這種影響的潛在作用機制尚未完全闡明。

許多研究表明,腦缺血后,神經功能損傷和細胞死亡在第一天達到峰值,然后逐漸減少并穩定[30]。腦缺血后早期的EA治療可以增加腦血流,降低腦缺血/再灌注損傷的程度,并擴大治療時間窗[31,32]。這表明針灸治療的最佳時間是缺血后3 h內。因此,我們選擇腦缺血損傷后1.5 h和腦缺血后1 d的EA作為觀察時間。既往研究表明,EA可以改善肢體運動功能,并對腦缺血/再灌注損傷具有一定的神經保護作用[33,34]。這項研究的結果表明,EA可以顯著改善腦缺血/再灌注后的神經功能缺損癥狀。

具有異常外觀的線粒體,如腫脹或無組織的線粒體,被認為是誘導缺血周圍區域凋亡的主要因素[35,36],導致神經元代謝和發育異常[37,38]。本研究發現EA治療的腦缺血/再灌注大鼠神經元變性或壞死減少。細胞焦亡最明顯的特征是迅速形成質膜孔、細胞腫脹和滲透性壞死,釋放大量細胞內容物和促炎介質,形成過度的炎性反應[39]。在MCAO組中,HE染色顯示細胞死亡、腦組織結構疏松、間質水腫、神經細胞紊亂和腫脹、固縮和細胞核碎裂的典型特征,神經細胞數量顯著減少。然而,在EA組中,這種現象的發生減少,僅在缺血病灶的周圍區域觀察到少量神經細胞變性和壞死。在TUNEL熒光染色中,發現在凋亡和局灶性細胞核中可以形成綠色或棕黃色顆粒沉淀,而正常細胞中沒有斷裂的DNA片段,不會與標記物反應,因此正常細胞核是藍色的[40]。此外,我們在TUNEL的基礎上添加了caspase-1染色,以鑒定caspase-1介導的神經元焦亡。在MCAO組大鼠種觀察到TUNEL和caspase-1雙染色神經元的陽性率顯著增加,這表明細胞焦亡與腦缺血/再灌注損傷有關。EA治療后大鼠的陽性率顯著降低,表明電針可以減少腦缺血/再灌注損傷后海馬CA1區神經元的焦亡,這可能是通過抑制caspase-1的表達實現的。先前的研究還表明,EA可以抑制腦缺血大鼠海馬中的神經元凋亡,并可以促進腦缺血/再灌注損傷后神經細胞的恢復[41]。此外,雙標記免疫熒光顯示,MCAO組大鼠神經元中NLRP3和caspase-1顯著共表達,這與之前報道結果[42,43]相似。EA組大鼠共表達神經元的數量減少,這表明EA治療可能抑制神經元焦亡。

總之,EA聯合高頻重復經顱刺激可以顯著改善腦缺血/再灌注損傷小鼠的神經損傷癥狀和腦細胞形態學變化,減少梗死面積,保護腦組織免受缺血損傷。這種治療減少了NLRP3、caspase-1的表達,減少了細胞凋亡和炎癥反應的發生,表明EA對腦缺血/再灌注損傷的保護作用可能是通過抑制NLRP3/caspase-1途徑發揮的。