溫肺化纖顆粒通過(guò)調(diào)節(jié)鐵死亡改善肺纖維化的機(jī)制研究

黎強(qiáng) 朱國(guó)雙 （江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種慢性、進(jìn)行性的，并對(duì)肺組織具有較強(qiáng)破壞性的纖維化性間質(zhì)性肺病，臨床上主要表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難并伴有肺功能下降［1］。病理學(xué)上肺纖維化主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞持續(xù)受損，成纖維細(xì)胞激活并分化為肌成纖維細(xì)胞，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在肺組織內(nèi)異常沉積，最終導(dǎo)致肺組織形成纖維性閉塞甚至“蜂窩狀”肺［2］。臨床上以特發(fā)性肺纖維化最為常見，且治療效果最差，平均生存周期為2.5～3.5 年［3］。目前臨床治療均不能延緩肺纖維化患者的疾病進(jìn)展，因而亟需新的治療思路和方法進(jìn)行防治。

細(xì)胞死亡有多種方式，鐵死亡是一種區(qū)別于細(xì)胞壞死、自噬及凋亡的新型細(xì)胞死亡方式［4］。通過(guò)對(duì)細(xì)胞線粒體基因庫(kù)的分析，發(fā)現(xiàn)鐵死亡由一個(gè)獨(dú)特的遺傳網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控，敲除該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因可以抑制細(xì)胞鐵死亡，但對(duì)細(xì)胞壞死、自噬及凋亡無(wú)明顯影響［5］。鐵死亡的發(fā)生，主要是由于鐵質(zhì)的大量堆積，導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)失衡，出現(xiàn)活性氧（ROS）和脂質(zhì)過(guò)氧化物的累積，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體損傷的發(fā)生。

溫肺化纖顆粒是導(dǎo)師劉良徛教授在傳承國(guó)醫(yī)大師洪廣祥教授“治肺不遠(yuǎn)溫”的學(xué)術(shù)思想指導(dǎo)下所創(chuàng)立，現(xiàn)已開發(fā)為江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑。溫肺化纖顆粒以治療“陰疽”的“陽(yáng)和湯”為基礎(chǔ)方，并予以蟲類藥物以達(dá)“搜剔竄透”之功。在前期研究中，課題組已證實(shí)溫肺化纖顆粒具有抗氧化作用，并能改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺臟損傷［6-8］。本研究將觀察溫肺化纖顆粒是否通過(guò)抑制鐵死亡達(dá)到改善肺纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性KM 小鼠50 只，體質(zhì)量（27.5±2.5）g，5～6 周齡，購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（贛）2018-0003。飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，所有小鼠均可自由飲水進(jìn)食。本研究通過(guò)江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，批件號(hào)：JZLLSC20210031。

1.2 藥物和試劑

博來(lái)霉素（浙江瀚暉制藥有限公司，批號(hào)：20067411），購(gòu)于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院高新醫(yī)院，使用時(shí)溶于0.9%生理鹽水中，濃度為5 mg/kg。溫肺化纖顆粒（江中制藥股份有限公司，批號(hào)：20030003），組成：熟地黃15 g，鹿角霜15 g，炮姜炭9 g，肉桂4 g，麻黃10 g，炙甘草10 g，白芥子10 g，土鱉蟲8 g，桃仁8 g，紅花10 g，川芎10 g，地龍10 g，規(guī)格為15 g/袋，購(gòu)于江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，使用時(shí)溶于0.9%生理鹽水中，濃度分別為0.292 5、0.585、1.17 g/mL。一抗NRF2 Rabbit mAb、NQO1 Rabbit mAb、Heme Oxygenase 1（HO-1/HMOX1）Rabbit mAb，二抗HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），購(gòu)于武漢愛博泰克（ABclone）生物科技有限公司。MDA、GSH、Fe 比色法測(cè)試盒，購(gòu)于武漢賽維爾生物科技股份有限公司。

1.3 造模、分組及給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將50 只小鼠分為對(duì)照組、模型組和溫肺化纖顆粒低劑量（WFHXL）、中劑量（WFHXM）、高劑量（WFHXH）組，造模前對(duì)各組小鼠進(jìn)行禁食禁水12 h，配制4%水合氯醛（0.1 mL/10 g）對(duì)各組小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，根據(jù)小鼠體重，進(jìn)行氣管內(nèi)一次性滴入博來(lái)霉素5 mg/kg 建立肺纖維化模型，對(duì)照組小鼠氣管內(nèi)給予等量的生理鹽水。造模后溫肺化纖顆粒灌胃劑量經(jīng)人與小鼠體表面積比值折算，中劑量為人與小鼠的等效劑量5.85 g/kg，低劑量為2.925 g/kg，高劑量為11.7 g/kg，每日1 次，給予藥物體積為0.1 mL/10 g 灌胃。模型組和對(duì)照組給予生理鹽水0.1 mL/10 g 灌胃，各組均連續(xù)灌胃28 d，期間小鼠可自由進(jìn)食、進(jìn)水。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥24 h 后，腹腔注射4% 水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉后處死小鼠，取各組小鼠左肺上葉固定于4%多聚甲醛中48 h，以備包埋切片，用于相關(guān)病理染色；余肺組織于-80 ℃冰箱保存。

1.4.1 病理染色 HE 染色：固定完成的肺臟組織進(jìn)行不同濃度乙醇梯度脫水、二甲苯透明，浸蠟2 h后，進(jìn)行石蠟包埋切片，并脫蠟至水，放入蘇木素中浸泡，自來(lái)水洗，然后再進(jìn)行1%鹽酸酒精分化，5 s 后，快速放入自來(lái)水中沖洗，然后進(jìn)行不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，以及中性樹脂封片，最后顯微鏡下鏡檢，并進(jìn)行圖像采集分析。

Masson 染色：取小鼠肺臟石蠟塊，常規(guī)脫蠟、乙醇梯度脫水，按照Masson 染色試劑盒說(shuō)明書，不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，最后于顯微鏡下觀察拍照。

1.4.2 Real-time PCR 檢測(cè) -80 ℃冰箱中取出小鼠肺臟組織，稱取20 mg 組織，進(jìn)行提取RNA，并測(cè)定RNA 濃度。測(cè)定完成后，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書進(jìn)行操作，完成逆轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行擴(kuò)增，共40 個(gè)循環(huán)。按2-ΔΔCt 法進(jìn)行定量分析，此次實(shí)驗(yàn)所需引物均由武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行合成，β-actin 為內(nèi)參。見表1。

表1 肺組織Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA引物序列

1.4.3 ELISA 檢測(cè) 4 ℃冰箱中取出GSH、Fe、MDA 試劑盒，室溫靜置20 min；-80 ℃冰箱中取出小鼠肺臟組織；設(shè)定測(cè)定孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和空白孔，每孔設(shè)定3 次重復(fù)。根據(jù)組織稱取重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例，制備10%勻漿液。在低溫高速離心機(jī)下，4 ℃ 1 500 r/min 離心10 min，收集上清液。采用比色法檢測(cè)上清液中的Fe 含量，并參照GSH、MDA 試劑盒制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出相應(yīng)的GSH、Fe、MDA 數(shù)值。

1.4.4 免疫組化法檢測(cè) 取小鼠肺臟石蠟塊，進(jìn)行常規(guī)切片、脫蠟，3%過(guò)氧化氫室溫清除過(guò)氧化物酶活性，純水沖洗3 次；然后將切片放入固定容器內(nèi)，加入PBS，置于高溫烤箱中，進(jìn)行高溫抗原修復(fù)，室溫15 min，5%山羊血清封閉，靜置15 min，甩去血清，加入一抗稀釋液，4℃過(guò)夜，進(jìn)行室溫復(fù)溫，而后PBS 沖洗3 次，每次5 min。滴加二抗稀釋液，37 ℃恒溫箱靜置30 min，PBS 沖洗3 次，每次5 min。最后進(jìn)行DAB 顯色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡拍照，Image J 1.44圖片分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD 法，方差不齊采用Dunnett T3 檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠病理染色結(jié)果

HE 和Masson 染色提示，對(duì)照組小鼠肺臟病理結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡間隔未見增生，未見藍(lán)色膠原纖維的沉積。與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺臟病理結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯破損，肺泡間隔明顯增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及纖維組織明顯增生，同時(shí)伴有明顯的藍(lán)色膠原纖維沉積。與模型組比較，溫肺化纖顆粒各組小鼠肺泡間隔稍增厚，肺泡間隔破損稍輕，纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，同時(shí)溫肺化纖顆粒各組小鼠肺臟藍(lán)色膠原纖維明顯減少，其中WFHXL組藍(lán)色膠原纖維含量最多，其次為WFHXH 組，而WFHXM 組膠原纖維含量最少。見圖1。

圖1 各組小鼠肺臟病理染色（HE和Masson染色，×200）

2.2 各組小鼠肺臟組織中GSH、MDA、Fe 含量檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺臟組織中MDA和Fe 含量明顯升高（P＜0.01），GSH 含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，溫肺化纖顆粒低、中、高劑量組小鼠肺臟組織中MDA 和Fe 含量明顯降低（P＜0.01），GSH 含量明顯升高（P＜0.01）；與WFHXL 組比較，WFHXM 組和WFHXH 組小鼠肺臟組織中MDA 和Fe 含量明顯降低（P＜0.01），GSH 含量明顯升高（P＜0.01）；且WFHXM 組治療效果要優(yōu)于WFHXH 組（P＜0.01）。見表2。

表2 溫肺化纖顆粒對(duì)小鼠肺臟組織GSH、MDA、Fe含量結(jié)果（，n=3）

表2 溫肺化纖顆粒對(duì)小鼠肺臟組織GSH、MDA、Fe含量結(jié)果（，n=3）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與WFHXL劑量組比較，▼P＜0.01；與WFHXH量組比較，▲P＜0.01。

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2.3 各組小鼠肺臟Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA表達(dá)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺臟組織中Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，溫肺化纖顆粒低、中、高劑量組小鼠肺臟組織中Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01)；與WFHXL 組比較，WFHXM 組和WFHXH 組小鼠肺臟組織中Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA 水平明顯升高（P＜0.01），且WFHXM 組優(yōu)于WFHXH 組（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組小鼠Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4 各組小鼠肺臟免疫組化結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺臟組織中Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表達(dá)水平明顯減少；與模型組比較，溫肺化纖顆粒低、中、高劑量組小鼠肺臟組織中Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表達(dá)水平明顯升高；與WFHXL 組比較，WFHXM 組和WFHXH 組小鼠肺臟組織中Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白水平明顯升高，且WFHXH 組低于WFHXM 組。見圖3。

圖3 各組小鼠肺臟免疫組化染色結(jié)果（×200）

3 討論

肺纖維化屬中醫(yī)“肺痿病”，“陽(yáng)虛”為肺纖維化發(fā)病之源。肺纖維化患者日久，陽(yáng)氣漸衰，導(dǎo)致血液和水液代謝異常，痰瘀形成。在病機(jī)上，則為陽(yáng)虛寒凝、痰滯血瘀。根據(jù)國(guó)醫(yī)大師洪廣祥教授“治肺不遠(yuǎn)溫”的學(xué)術(shù)思想，針對(duì)肺纖維化陽(yáng)虛寒凝、痰滯血瘀之病機(jī)，本研究采用具有溫化寒飲、化痰祛瘀功效的溫肺化纖顆粒進(jìn)行治療。

肺纖維化是以肺泡上皮細(xì)胞損傷、成纖維細(xì)胞增殖活化以及細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的間質(zhì)性肺病。鐵死亡是一種以鐵離子沉積、ROS 和脂質(zhì)過(guò)氧化物累積，以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）表達(dá)受抑制的細(xì)胞死亡方式。研究發(fā)現(xiàn)，該死亡形式的發(fā)生可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化（FMT），導(dǎo)致肺臟發(fā)生病理?yè)p傷，最終形成肺纖維化，并在其機(jī)制中發(fā)生關(guān)鍵作用［9-10］。

研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化可伴隨鐵和脂質(zhì)過(guò)氧化物代謝失衡現(xiàn)象［11-14］。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵過(guò)量時(shí)，細(xì)胞代謝過(guò)程中生成的過(guò)氧化氫和超氧自由基陰離子會(huì)與胞內(nèi)過(guò)量的鐵發(fā)生Fenton 反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化為對(duì)大分子物質(zhì)具有高反應(yīng)性的羥自由基，其中具有抗氧化應(yīng)激的谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）的含量降低，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)大量的ROS 和脂質(zhì)過(guò)氧化物累積，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)的主要控制器核因子紅細(xì)胞系2 相關(guān)因子2（Nrf2）含量降低，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，并最終引發(fā)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

在本研究中，通過(guò)小鼠氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素，以模擬人肺纖維化發(fā)生。在HE 和Masson 染色結(jié)果中證實(shí)，小鼠肺臟組織出現(xiàn)明顯的肺泡結(jié)構(gòu)破損、肺泡壁增厚、纖維組織增生和藍(lán)色膠原纖維沉積等肺纖維化表現(xiàn)。在進(jìn)一步的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，肺纖維化小鼠肺臟中鐵離子含量以及脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA 含量增加，抗氧化應(yīng)激的GSH 含量降低，抑制鐵死亡相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 表達(dá)明顯降低，表明博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化可能是由于鐵死亡發(fā)生所致。給予溫肺化纖顆粒干預(yù)后，各組小鼠肺泡壁稍增厚，未見明顯的肺泡結(jié)構(gòu)破損，纖維組織增生和藍(lán)色膠原纖維沉積得到明顯改善，表明溫肺化纖顆?？捎行p輕肺臟病理?yè)p傷。而在鐵死亡相關(guān)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，各組小鼠肺臟中鐵離子含量、脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA 含量明顯減少，而抗氧化應(yīng)激的GSH 含量增加，以及抑制鐵死亡相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 表達(dá)明顯增加，這表明溫肺化纖顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制鐵死亡達(dá)到改善肺纖維化的作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，初步從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)溫肺化纖顆粒改善PF 的治療做了簡(jiǎn)單的論述，對(duì)于溫肺化纖顆粒抑制鐵死亡的具體作用機(jī)制尚未闡述。今后本課題組將進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建肺纖維化模型，探討鐵死亡在肺纖維化中發(fā)生的具體作用機(jī)制以及溫肺化纖顆粒的干預(yù)作用。