草珊瑚多糖消炎止血和抗氧化活性研究初探

馬秋婷 朱鈺晨 萬小光 洪滔 張鴻 劉志勇 （.江西中醫藥大學 南昌 330004；.江西草珊瑚科技有限公司 南昌 33009）

草珊瑚，又名腫節風、接骨木、竹節茶等，最早以“接骨草”見于《本草拾遺》［1］，是金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai 的干燥全草，主要分布于長江流域以南的大部分地區，如江西、福建、貴州等地，也是閩南道地藥材之一［2］。草珊瑚性味苦、辛、平，歸心、肝經，具有清熱涼血、解毒消斑、祛風止痛等功效［3］?，F代藥理學研究發現其主要有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用，因其毒副作用小、具有較好的消炎止痛等療效［4］。在臨床應用中具有較高的應用價值，常用來治療感冒高熱、瘡瘍膿腫、血熱紫斑、紫癜、燒傷、 風濕痹痛、跌打損傷等疾?。?］。目前，國內以草珊瑚為主要原料生產多種中成藥產品，例如草珊瑚含片、腫節風浸膏、血康口服液、腫節風片等，臨床應用廣泛。除藥用以外，草珊瑚在我國還有悠久的食用歷史，民間有用水沖泡茶飲的習俗。

草珊瑚中含有多種化學成分，主要有香豆素類、黃酮類、酚酸類、倍半萜類、大分子蛋白和多糖類等［6］。研究發現，多糖作為中藥的活性物質之一，具有廣泛的藥理活性，因其毒副作用小、功能廣泛、安全性高，被廣泛關注。據相關報道，草珊瑚多糖是草珊瑚中水溶性成分，為抗免疫性血小板減少性紫癜的有效成分［7］。草珊瑚中一些酸性多糖結構也具有較好的抗炎、抗氧化活性［8］，但相關研究較少。因此，本次研究通過氧化自由基清除和大鼠足腫脹實驗來驗證其抗氧化抗炎能力，采用小鼠斷尾止血實驗驗證其止血能力。

1 儀器和材料

1.1 主要材料與試劑

95%乙醇（西隴化工股份有限公司）；DPPH（源葉生物，批號：A800764）；ABTS（上海麥克林生化科技有限公司，MB3206）；抗壞血酸（Solarbio，貨號：A8100）；角叉菜膠（Solarbio，貨號C8830）；以上試劑純度均為分析純。草珊瑚飲片（江西匯中中藥股份有限公司）；云南白藥（云南白藥集團有限公司）；阿司匹林（石藥集團歐意藥業有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

水浴鍋（上海躍進醫療器械有限公司，型號HH.WB22-550-11）；超聲波清洗機（上海躍進醫用光學器械廠，型號CQ-250A-DST）；離心機（Cence 湘儀，型號TDZ5-WS）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠，型號RE5205）；冷凍干燥機（美國LABCONCO 公司）；電子分析天平（北京塞多利斯天平有限公司）；純水儀（型號Milli-Q-Zntegral 10，江西鼎技科學儀器有限公司，型號BS200S-WEI）；旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號VORTEX-6）；多功能酶標儀（Thermo 公司）。

1.3 實驗動物

小鼠為SPF 級昆明種雄性健康小白鼠50 只，體重18～22 g。大鼠為SPF 級雌性SD 大鼠48 只，體重200～220 g，由江西中醫藥大學實驗動物科技中心提供，飼養在江西中醫藥大學實驗動物科技中心SPF 級屏障系統內，環境溫度為20～23 ℃、濕度45%～55%。實驗動物合格證編號：SYXK（贛）2022-0002，使用許可證編號：SCXK（贛）2018-0003，受理編號：20221129004。本項目全程注意實驗動物福利倫理，遵循3R 原則，項目得到江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會的批準。

2 方法

2.1 草珊瑚多糖的提取

參照邵佳等［9］的提取方法并稍作修改。取草珊瑚全草飲片30 g，置于圓底燒瓶中，采用水提醇沉法，按提取溫度95 ℃，提取時間4 h，料液比1∶20回流提取3 次，合并濾液，抽濾，減壓濃縮至體積的1/4，加入3 倍量的95%乙醇，慢加快攪，4 ℃醇沉過夜，棄去上清液，取下層沉淀，3 000 r/min 離心10 min，得多糖沉淀，冷凍干燥，即得草珊瑚粗多糖。

2.2 草珊瑚粗多糖得率的計算

2.3 草珊瑚多糖的抗氧化能力測定

2.3.1 草珊瑚多糖DPPH 自由基清除活性 用無水乙醇配置0.05 mg/mL 的DPPH 溶液。多糖樣品用超純水溶解，制成質量濃度為1 mg/mL 的多糖溶液，然后配成質量濃度為0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 的待測多糖樣品溶液。取100 μL 多糖樣品與100 μL DPPH 混合液，于517 nm 測定吸光度，作為樣品組；測定100 μL 多糖樣品與100 μL 蒸餾水混合液的吸光度，作為空白組；測定100 μL 蒸餾水和100 μL DPPH 混合液的吸光度，作為對照組。室溫下避光放置20 min，于517 nm 處測定吸光度。以抗壞血酸（Vc）作為陽性對照，平行測定3 次。按照下列公式計算DPPH 自由基清除能力。

公式中A樣品組：100 μL 樣品液+100 μL DPPH混合液；A空白組：100 μL 樣品液+100 μL 蒸餾水；A對照組：100 μL 蒸餾水+100 μL DPPH 混合液。

2.3.2 草珊瑚多糖ABTS 自由基清除活性 根據Liu等［10］的方法進行測定并稍作修改。配制7 mmol/L ABTS 和4.96 mmol/L 過硫酸鉀等體積混合，在室溫下避光靜置12～16 h，得到ABTS 自由基儲備液。然后用無水乙醇將混合液稀釋至40 倍。多糖樣品用超純水溶解，制成質量濃度為1 mg/mL 的多糖溶液，然后配成質量濃度為0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 的待測多糖樣品溶液。于96 孔板中，分別加入不同濃度的多糖樣品溶液50 μL 與150 μL ABTS 混合液，作為樣品組；以150 μL 蒸餾水替代ABTS 混合液，作為空白組；50 μL 蒸餾水與150 μL ABTS 混合液，作為對照組。避光靜置20 min。在酶標儀下測定734 nm 處的吸光度，平行測定3 次，按照下列公式計算每個濃度的ABTS 清除率（%）。

公式中A樣品組：50 μL 樣品液+150 μL ABTS 混合液；A空白組：50 μL 樣品液+150 μL 蒸餾水；A對照組：50 μL 蒸餾水+150 μLABTS 混合液。

2.4 草珊瑚體內止血實驗

2.4.1 分組及給藥 將小鼠隨機分為5 組，分別為空白對照組，陽性組（云南白藥組50 mg/kg），草珊瑚低、中、高劑量組（35、70、140 mg/kg），每組10 只?？瞻讓φ战M灌胃同等體積的生理鹽水，給藥組分別灌胃不同濃度的草珊瑚多糖溶液，每日1次，連續6 d。

2.4.2 小鼠出血時間的測定 在第6 次給藥0.5 h后，剪斷小鼠尾尖（約0.3 cm），待血液自行溢出開始計時，每隔15 s 用濾紙吸去血滴，直至濾紙吸時無血停止計時，即為出血時間。

2.5 大鼠足腫脹實驗

2.5.1 分組及給藥 將大鼠分為6 組，每組8 只，分別分為正常對照組、模型組、陽性組（阿司匹林組）、給藥組（草珊瑚多糖低、中、高劑量組）。正常對照組和模型組均灌胃同體積的生理鹽水；陽性組給藥劑量為50 mg/kg；給藥組的低、中、高劑量分別為50、100、200 mg/kg。每日1 次，連續6 d。

2.5.2 大鼠足腫脹的測定 實驗開始前，分別在每只大鼠左后足部做標記，測定大鼠未造模前的初始容積。按實驗分組進行灌胃，記錄灌胃時間；灌胃1 h 后，將0.1 mL 的1%角叉菜膠分別皮下注入模型組、陽性藥、給藥組大鼠左后足掌中間區域。分別在注入角叉菜膠0、1、2、4 h 后測定足趾容積，足腫脹度即為注射角叉菜膠后的足趾容積減去未造模前的初始容積。

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2.6 數據處理

實驗數據采用SPSS 26 統計軟件進行分析，各項指標采用均數±標準差（）表示，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。本實驗所用圖譜均采用Graphprism 9.3.1 軟件作圖。

3 結果

3.1 草珊瑚多糖得率結果

根據以上提取條件，平行測定3 次，通過計算得出草珊瑚多糖的平均得率為6.31%。

3.2 草珊瑚多糖抗氧化能力

3.2.1 草珊瑚多糖DPPH 自由基清除活性 結果顯示，草珊瑚多糖對DPPH 清除能力隨著多糖濃度的增加而增強，當濃度在0.6～0.8 mg/mL 范圍內清除能力趨于穩定，0.8 mg/mL 時，為73.97%，雖然沒有達到維生素C 的清除能力，但草珊瑚多糖對DPPH 的清除能力仍較強，具有較強的抗氧化能力。見圖1。

圖1 DPPH自由基清除能力

3.2.2 ABTS 抗氧化能力 結果顯示，草珊瑚多糖對ABTS 清除能力隨著多糖質量濃度增大而增強，在一定濃度范圍內，呈現劑量依賴型，當草珊瑚多糖濃度為0.8 mg/mL 時其抗氧化能力最高，對ABTS 的清除率高達88.76%，接近于維生素C 的自由基清除能力，說明草珊瑚多糖具有較強的抗氧化能力。見圖2。

圖2 ABTS自由基清除能力

3.3 對小鼠斷尾出血時間的影響

小鼠予草珊瑚多糖灌胃后，與正常對照組相比，陽性組出血時間顯著降低（P＜0.01）；草珊瑚多糖對小鼠的出血時間隨著給藥濃度的增加而降低，其中，與正常對照組相比，草珊瑚多糖中劑量組有顯著性差異（P＜0.05），高劑量出血時間顯著降低（P＜0.01），而草珊瑚低劑量組則無統計學意義。與陽性組相比，草珊瑚高劑量組雖無統計學意義，但對小鼠的出血時間低于陽性組。表明草珊瑚多糖劑量為70 mg/kg 時，具有較好的止血效果；當劑量為140 mg/kg 時，小鼠的止血效果優于陽性組。見表1。

表1 草珊瑚多糖的出血時間（，n=10）

表1 草珊瑚多糖的出血時間（，n=10）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.4 對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響

大鼠注射角叉菜膠后，分別在0、1、2、4 h測量足趾容積。其中在0、1、2 h 時，陽性組和給藥組的大鼠足趾容積均有不同程度增高，但在4 h 時，足腫脹度明顯降低，與模型組相比，草珊瑚高劑量組有顯著性差異（P＜0.05）。草珊瑚低劑量組和中劑量組雖與模型組無統計學意義，但在注射角叉菜膠4 h 后，足腫脹度均有不同程度降低。見表2。

表2 各組大鼠致炎后不同時間足腫脹度的測量結果（，n=10） mL

表2 各組大鼠致炎后不同時間足腫脹度的測量結果（，n=10） mL

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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4 討論

正常情況下，人體自由基產生與清除是一個動態平衡狀態。一旦這種平衡被打破，會導致疾病的發生，如癌癥、糖尿病、心血管疾病等［11-13］，這些疾病的發生被認為與自由基息息相關。抗氧化劑能夠有效地清除自由基，使機體免受自由基的損傷，受到廣泛應用。目前大多數抗氧化劑多為人工合成的，長期使用會產生副作用。因此，開發安全無副作用的天然抗氧化劑具有重要意義。本次試驗以DPPH和ABTS 清除能力為指標，驗證草珊瑚多糖的抗氧化作用。結果顯示：不同濃度的草珊瑚多糖均可以有效清除DPPH 自由基和ABTS 自由基，其自由基清除率雖低于維生素C，但呈現劑量依賴性。當草珊瑚多糖濃度為0.8 mg/mL 時，對DPPH 的清除能力達到73.97%，對ABTS 的清除能力高達88.76%。

機體正常止血和凝血機制與血管壁、血小板、凝血因子、抗凝因子、纖溶系統及其相互之間的生理性調節和平衡息息相關［14］。在止血試驗中，通過斷尾法測定小鼠出血時間來評價草珊瑚多糖的止血活性。結果表明，草珊瑚多糖可顯著縮短小鼠出血時間，高劑量組優于陽性對照組（云南白藥），且作用效果與劑量成正相關。

草珊瑚多糖是草珊瑚主要的抗炎成分之一［15］，有研究表明通過建立LPS 誘導的RAW264.7 細胞炎癥模型，驗證了草珊瑚多糖的體外抗炎作用［16］。因此，本實驗通過角叉菜膠致大鼠足腫脹試驗建立動物急性非特異性炎癥模型，以足趾容積為觀察點，考察草珊瑚多糖的體內抗炎效果。結果表明，高劑量的草珊瑚多糖在注射角叉菜膠4 h 后抑制作用明顯，與模型組相比有顯著性差異（P＜0.05）。前人研究結果和本次研究結果均表明草珊瑚多糖具有一定的抗炎作用，可為臨床應用草珊瑚多糖治療急性非特異性炎癥等疾病提供試驗資料，但其抗炎作用機制有待進一步研究。

綜上所述，草珊瑚多糖具有一定的抗氧化和消炎止血作用，可為草珊瑚多糖藥物與功能性食品的開發提供了理論依據，或可開發成具有消炎止血活性的口腔護理用品。然而，其相關作用機制尚不明確，還需作進一步的研究和探討。