鐵皮石斛多糖的提取工藝及對小鼠急性肺損傷改善作用的研究Δ

劉子菁，從靜文，程 卓，牟 琳，吳汐柔，王子豪，楊俊顏，信小兵 （新疆第二醫學院藥學院，新疆 克拉瑪依 834000）

鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛Dendrobiumoffici-naleKimura et Migo的干燥莖，主要分布在我國安徽、四川、浙江、云南、江西等地。該藥主要含有多糖、生物堿、氨基酸和微量元素等化學成分，具有抗腫瘤、抗衰老、抗急性肺損傷（acute lung injury，ALI）、擴張血管和抗血小板凝集等多種藥理作用[1]。目前，國內外多糖的提取方法很多，主要包括浸漬法、回流法、超聲法、微波法、酶解法、閃式提取法、凍融提取法等，但單一提取法存在提取率低、工藝復雜、提取物雜質多等弊端[2]。

ALI是一種由各種肺內（吸入、注射、感染及創傷等）或肺外（休克、膿毒癥等）致病因素導致肺泡結構受損而引發肺部彌散性炎癥和水腫反應的呼吸系統疾病。目前，臨床尚無治療ALI 的特效藥物，故其病死率維持在較高水平，整體病死率高達40%[2]。現代醫學認為，ALI的病理學機制主要與肺組織局部過度的氧化應激和炎癥反應有關[3―4]。多糖作為鐵皮石斛的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化作用，且毒性極低[5―6]。基于此，本研究以鐵皮石斛為原料，采用超聲輔助熱水浸漬法提取鐵皮石斛多糖，通過單因素實驗和Box-Behnken 響應面法優化提取工藝，并考察鐵皮石斛多糖對小鼠ALI 的影響，為鐵皮石斛多糖的提取及藥效研究提供理論依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括UV1802G型紫外-可見分光光度計（天津冠澤科技有限公司）、FW135 型粉碎機（北京市永光明醫療儀器有限公司）、LEICARM2245 型石蠟切片機（常州市雅博電子設備有限公司）、Axio-ImagerA2型蔡司正置熒光顯微鏡（北京博瑞斯科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

鐵皮石斛藥材購自南寧市藥材市場，經廣西中醫藥大學藥學院譚勇教授鑒定為蘭科植物鐵皮石斛D.officinaleKimura et Migo 的干燥莖；醋酸潑尼松片（批號20220313，規格5 mg）購自上海金不換蘭考制藥有限公司；濃硫酸（批號20190301）購自新疆德瑞生物有限公司；苯酚（分析純）購自天津市風船化學世紀科技有限公司；D（+）-無水葡萄糖對照品（批號110833-201906，純度≥98%）和脂多糖對照品（批號20220208，純度≥98%）均購自北京索萊寶科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號20190608）、Masson 染色試劑盒（批號20180302）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗動物

昆明小鼠90 只，雄性，SPF 級，體重20～22 g，購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司，生產許可證號為SCXK（豫）2020-0005。本實驗方案經新疆醫科大學實驗動物倫理委員會審批，倫理審批號為IACUC-20220728-10。

2 方法與結果

2.1 鐵皮石斛多糖的提取

稱取鐵皮石斛藥材5 g，水洗后置于60 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎，過40 目篩；粗粉加入10 倍量水，于70 ℃下以700 W 功率超聲浸提，抽濾，濾液濃縮至原液的1/3，再加入3 倍量的無水乙醇，于4 ℃下靜置12 h 后濾過，收集沉淀，置于50 ℃烘箱中烘干，得多糖粉末并按下式計算鐵皮石斛多糖得率：多糖得率（%）＝多糖粉末質量/鐵皮石斛質量×100%。

2.2 鐵皮石斛多糖含量和提取率測定

2.2.1 多糖含量

采用苯酚-硫酸法進行測定[7]。精確稱取D（+）-無水葡萄糖對照品50 mg，加水定容至50 mL 容量瓶中，得1 mg/mL 的無水葡萄糖標準溶液。分別準確量取上述標準溶液0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL 于試管中，加水定容至2 mL。吸取5%苯酚溶液1 mL，分別加到6只試管中，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，靜置5 min，于沸水中加熱15 min，取出冷卻至室溫。采用紫外-可見分光光度計于490 nm 波長處測定吸光度（A）值。以無水葡萄糖質量濃度（c）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標，繪制無水葡萄糖標準曲線，得標準曲線方程為A＝14.707c+0.028 7（R2＝0.999 2）。方法學考察符合2020年版《中國藥典》（四部）的相關要求。

2.2.2 多糖提取率

精確稱取鐵皮石斛多糖粉末2.0 g，加水定容至100 mL 容量瓶中，搖勻，準確量取該多糖待檢測溶液1.0 mL，加水定容至2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，靜置5 min，于沸水中加熱15 min，取出冷卻至室溫。采用紫外-可見分光光度計于490 nm波長處測定A值，代入“2.2.1”項下標準曲線方程計算多糖質量濃度，并按下式計算鐵皮石斛多糖提取率：多糖提取率＝提取液中多糖質量濃度×提取體積/鐵皮石斛多糖粉末質量×100%。

2.3 鐵皮石斛多糖提取工藝優化

2.3.1 單因素實驗

前期預實驗結果表明，料液比、提取時間、提取溫度均能顯著影響鐵皮石斛多糖的提取率，因此本研究選擇料液比、提取時間、提取溫度為因素進行單因素實驗。分別稱取鐵皮石斛藥材0.2 g，共5 份，按“2.1”項下方法操作。其中，料液比單因素實驗條件如下：以700 W功率超聲15 min，提取溫度為70 ℃，提取2 次，提取時間為2 h，設置料液比（g/mL，下同）分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40；提取時間單因素實驗條件如下：以700 W功率超聲15 min，提取溫度為70 ℃，提取2 次，料液比為1∶30，設置提取時間分別為1、2、3、4、5 h；提取溫度單因素實驗條件如下：以700 W 功率超聲15 min，提取時間為2 h，提取2次，料液比為1∶30，設置提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃。考察各因素對鐵皮石斛多糖提取率的影響，結果見圖1。

圖1 料液比、提取時間、提取溫度對鐵皮石斛多糖提取率的影響

由圖1A 可以看出，鐵皮石斛多糖提取率隨料液比的改變呈現波浪形變化，當料液比為1∶30時，鐵皮石斛多糖提取率達到最大值；由圖1B可以看出，鐵皮石斛多糖提取率隨提取時間的延長先升高后降低，當提取時間為2 h時，鐵皮石斛提取率達到最大值；由圖1C可以看出，鐵皮石斛多糖提取率隨提取溫度的升高先升高后降低，當提取溫度為60 ℃時，鐵皮石斛多糖提取率達到最大值。

2.3.2 Box-Behnken響應面實驗

基于單因素實驗結果，根據Box-Behnken 實驗設計原理，以提取溫度（A）、料液比（B）、提取時間（C）為考察因素，鐵皮石斛多糖提取率（Y）為響應值，設計3 因素3水平的提取工藝優化實驗。Box-Behnken響應面實驗因素與水平見表1，設計方案與結果見表2。

表1 Box-Behnken響應面實驗因素與水平

表2 Box-Behnken響應面實驗設計方案與結果

應用Design-Expert 12 軟件對表2 數據進行回歸擬合，得到回歸方程為Y＝34.00+0.53A－0.63B－2.90C－1.25AB+3.81AC+2.13BC－3.78A2+2.28B2－2.78C2。對回歸方程進行方差分析，結果見表3。由表3顯示，該模型的F值為20.66，P＜0.01，表明該回歸方程的擬合度較好；失擬項P＞0.05，表明該模型成立；模型的相關系數R2為0.963 7，表明96.37%的多糖提取率變化可用該模型解釋；此外，各因素響應值的影響大小排序為C（提取時間）＞B（料液比）＞A（提取溫度）。

表3 Box-Behnken響應面實驗回歸方程的方差分析結果

運用Design-Export 12 軟件繪制各因素交互作用的響應面圖和等高線圖（圖2）。響應面圖的陡峭程度以及等高線圖的形狀可以直觀反映出各影響因素之間的交互作用對響應值影響的強弱：響應面圖越陡峭，說明兩因素交互作用對響應值的影響越顯著，響應面圖越平緩則兩因素交互作用的影響越不顯著；等高線呈橢圓形或馬鞍形，表示兩因素交互作用的影響顯著，若呈圓形則表示兩因素交互作用的影響不顯著。

圖2 各因素交互作用對鐵皮石斛多糖提取率影響的響應面圖和等高線圖

由圖2 可以看出，提取溫度和提取時間兩因素之間的響應面陡峭，等高線趨于橢圓，說明兩因素交互作用對響應值的影響顯著；但提取溫度和料液比以及料液比和提取時間的響應面坡度變化不明顯，等高線不呈橢圓形，說明兩因素交互作用的影響不顯著，與回歸模型分析結果一致。

通過Design-Expert 12 軟件求解回歸方程，得到最優提取工藝因素為料液比1∶25，提取時間1.087 h，提取溫度57.76 ℃，鐵皮石斛多糖提取率的預測值為38.63%。考慮到實際生產的可操作性，本研究將最優提取工藝修正為料液比1∶25，提取時間1 h，提取溫度58 ℃。對此優化條件進行3次重復驗證實驗，結果顯示，鐵皮石斛多糖提取率的平均實測值為37.75%（RSD＝1.12%），與預測值的相對誤差為2.28%，表明所得工藝可行。

2.4 鐵皮石斛多糖對小鼠ALI的影響

2.4.1 分組、給藥、造模與取樣

將昆明小鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組（醋酸潑尼松）和鐵皮石斛多糖低、中、高劑量組，每組15只。鐵皮石斛多糖低、中、高劑量組小鼠的給藥劑量根據本課題組前期預實驗結果分別設置為50、100、200 mg/kg（以鐵皮石斛多糖粉末質量計），陽性對照組小鼠的給藥劑量根據參考文獻設置為5 mg/kg[8―9]，空白對照組和模型組小鼠給予等體積生理鹽水，每天灌胃1次，連續7 d。末次給藥1 h后，除空白對照組小鼠于氣管內滴注等體積生理鹽水外，其余各組小鼠均于氣管內滴注脂多糖10 mg/kg以復制ALI模型。24 h后，處死各組小鼠，取其肺臟，備用。

2.4.2 鐵皮石斛多糖對ALI模型小鼠肺濕/干重比的影響

取各組小鼠右肺下葉，用預冷的生理鹽水洗凈表面血漬，用濾紙吸干稱重（濕重）后，放入70 ℃烘箱中烘烤72 h，再次稱重（干重）并計算肺濕/干重比：肺濕/干重比＝肺濕重/肺干重。

2.4.3 鐵皮石斛多糖對ALI 模型小鼠肺組織病理形態的影響

取各組小鼠右肺組織，放入4%中性福爾馬林中固定24 h，再經梯度乙醇脫水、石蠟包埋后切片，分別進行HE和Masson染色，觀察肺組織病理形態學改變。

2.4.4 數據處理

2.4.5 結果

與空白對照組（8.38±1.25）比較，模型組小鼠肺濕/干重比（16.90±2.19）顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組（9.83±1.29）和鐵皮石斛多糖低、中、高劑量組（14.85±2.08、11.80±1.82、10.43±1.14）小鼠肺濕/干重比均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

空白對照組小鼠肺組織結構完整清晰，無水腫現象，肺泡間隔未見增厚；與空白對照組比較，模型組小鼠肺泡結構嚴重受損，肺泡間隔明顯增寬，大量炎癥細胞浸潤及成纖維細胞增生；與模型組比較，陽性對照組和鐵皮石斛多糖低、中、高劑量組小鼠肺損傷情況均有不同程度緩解，其中陽性對照組和鐵皮石斛多糖高劑量組緩解效果更好。結果見圖3、圖4。

圖3 各組小鼠肺組織的HE染色顯微圖（標尺＝50 μm）

圖4 各組小鼠肺組織的Masson 染色顯微圖（標尺＝50 μm）

3 討論

Box-Behnken響應面法可研究多個影響因素之間的交互作用，并可結合回歸分析對工藝條件進行合理優化。傳統的正交實驗僅能處理離散的水平值，無法獲得整個區域中設定影響因素的最優組合和響應值的最優值，而Box-Behnken 響應面法可以克服上述缺陷。該法通過理論分析和模擬驗證，評價提取工藝的影響因素，進而優化提取工藝參數。本研究通過單因素實驗和Box-Behnken響應面法優化得鐵皮石斛多糖的最優提取工藝為：料液比1∶25，提取時間1 h，提取溫度58 ℃。該工藝所得鐵皮石斛多糖的平均提取率為37.75%（n＝3），與預測值（38.63%）接近。

ALI是各種直接和間接致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成肺水腫，從而引發急性低氧呼吸功能不全的臨床綜合征[10]。脂多糖是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，是一種內毒素，可以刺激炎癥因子和炎性介質的產生，引發機體炎癥反應。本研究采用氣管滴注脂多糖的方式誘導建立小鼠ALI模型，探討鐵皮石斛多糖對小鼠ALI的影響。結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠肺濕/干重比顯著升高，肺組織可見肺泡結構嚴重受損、肺泡間隔明顯增寬、大量炎癥細胞浸潤及成纖維細胞增生等ALI 病理特征，表明ALI模型復制成功。與模型組比較，陽性對照組和鐵皮石斛多糖低、中、高劑量組小鼠肺濕/干重比均顯著降低，上述病理改變均有所緩解，可見鐵皮石斛多糖對脂多糖誘導的小鼠ALI有改善作用。

綜上所述，本研究優化的鐵皮石斛多糖提取工藝可行，且所得多糖對小鼠ALI有一定的改善作用。