過敏性鼻炎與過敏性哮喘及非過敏性哮喘的因果關系分析

林俊濤，曹昉欣，楊蓋，王欣童，林娜

1 右江民族醫學院研究生學院，廣西百色533000；2 右江民族醫學院附屬醫院兒科

哮喘是一種發生于呼吸道的過敏性炎癥，也是一種非傳染性慢性疾?。?］。哮喘可分為過敏性哮喘和非過敏性哮喘兩大表型，過敏性哮喘的臨床表現與非過敏性哮喘既有相似性又存在明顯差異［2］。現有研究表明，過敏性鼻炎（AR）與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間關系密切［3-4］，深入探究三者之間的因果關系對AR所導致哮喘表型的預防和治療具有重要意義。觀察性研究并不能明確AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間的因果關系，且難以避免反向因果關系、樣本量少及難以剔除的混雜因素，導致AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間的因果關系難以明確。孟德爾隨機化（MR）研究利用與暴露因素具有強相關的遺傳變異作為工具變量，借此推斷暴露因素與研究結局之間的因果效應。MR遵循隨機分配原則，混雜因素的影響在很大程度上是可控的，且遺傳變異工具變量發生于疾病及表型發生之前，可有效避免反向因果關系。2023年1—7月，本研究利用全基因組關聯研究（GWAS）數據進行兩樣本MR研究，以闡明AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間的因果關系，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例數據來源 通過GWAS匯總數據集的遺傳關聯數據庫IEU OpenGWAS project（https：//gwas.mrcieu.ac.uk）［5］，篩選并提取與AR、過敏性哮喘、非過敏性哮喘相關的GWAS數據集，將具有代表性的相關GWAS數據進行分析。GWAS數據來自歐洲人群，能有效避免人群異質性偏倚，其中AR包含112 583例受試者（GWAS ID ukb-b-7178，AR病例組25 486例、健康對照組87 097例），過敏性哮喘包含135 910例受試者（GWAS ID finn-b-ALLERG_ASTHMA_EXMORE，過敏性哮喘病例組4 859例、健康對照組131 051例），非過敏性哮喘包含134 760例受試者（GWAS ID finn-b-NONALLERG_ASTHMA_EXMORE，非過敏性哮喘病例組3 709例、健康對照組131 051例）。

1.2 疾病顯著相關單核苷酸多態性（SNP）位點篩選 MR所選取的工具變量SNP需滿足三大假設：相關性假設，即SNP與AR強相關；排他性假設，即SNP與過敏性哮喘及非過敏性哮喘無關，SNP只能通過AR對過敏性哮喘或非過敏性哮喘發生作用；獨立性假設，即SNP與混淆因素無關。從所篩選AR相關GWAS數據集中提取與AR顯著相關的SNP進行后續分析，其中相關性滿足P＜5E-08。

1.3 工具變量選擇 為確保所篩選的AR顯著相關SNP是獨立的，設置連鎖不平衡參數閾值（r2＜0.001，kb＞10 000），排除連鎖不平衡對結果的影響。工具變量若納入兩個高度相關位點，相當于對結果重復加權，會造成結果發生偏倚。計算F統計量，計算公式為F=R2×（n-k-1）÷［k×（1-R2）］，其中n表示樣本數量，k表示所選取的工具變量SNP的數量，R2表示工具變量解釋暴露的程度。R2=［2×（1-MAF）×MAF×β2］/［2×（1-MAF）×MAF×β2+（SE）2×2×N×（1-MAF）×MAF］，其中MAF為最小等位基因頻率，在計算R2時MAF可以和效應等位基因頻率等價，β為等位基因效應值，SE為β的標準誤。F統計量用于評估是否為弱工具變量偏倚，F＜10表明該SNP為弱工具變量或工具變量僅能解釋小部分表型變異，需剔除這部分SNP，避免對結果造成影響。通過數據庫Pheno Scanner（V2）（http：//www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk/）［6-7］，檢驗所選擇工具變量是否與混雜因素相關，排除其對應表型與結局變量具有強相關意義的SNP，即排除混雜因素對結局變量的影響。通過harmonise_data函數將所篩選的SNP效應等位基因對齊，即把暴露和結局的SNP進行協同，剔除具有中等頻率等位基因回文序列的SNP，避免因為這些位點變化導致結果不穩定。通過孟德爾隨機多態性殘差和離群值（MR-PRESSO）檢驗，將離群值剔除，并重新進行分析。最終選取的SNP位點即為研究AR與過敏性哮喘或非過敏性哮喘因果關系的工具變量。

1.4 AR與過敏性哮喘、非過敏性哮喘因果關系的MR分析方法 MR遵循孟德爾第二定律隨機分配實現隨機分組，借助工具變量SNP進行隨機化，模擬隨機對照研究。采用逆方差加權法（IVW）、加權中位數法（WME）和MR-Egger回歸模型進行MR分析。IVW特點是回歸時不考慮截距項存在并且用結局方差的倒數作為權重來進行擬合，P＜0.05提示MR分析存在潛在的因果關系。WME定義為比率估計值的加權中位數，若分析中至少有一半的信息來自有效工具，則可以評價因果關系。MR-Egger回歸法在回歸時考慮截距項存在，使用結局方差的倒數作為權重來進行擬合。

1.5 統計學方法 采用異質性檢驗、水平多效性檢驗、漏斗圖及留一法評估結果的可靠性。使用R軟件（version 4.2.1）的TwoSampleMR包［8］。采用Cochran′sQ檢驗和漏斗圖進行異質性分析，Cochran′sQ檢驗P＜0.05表示分析結果具有顯著異質性，漏斗散點圖呈對稱狀提示無偏倚。采用MREgger截距測試進行水平多效性分析，若MR-Egger截距測試分析中的截距項有統計學意義，則表明MR分析具有明顯水平多效性。采用留一法敏感性檢驗進行敏感性分析，通過逐一排除SNP來判斷MR結果的穩定性。

2 結果

2.1 AR與過敏性哮喘因果關系分析結果 將AR數據與過敏性哮喘數據匹配后，剔除具有中等頻率等位基因回文序列的SNP位點rs7774620，剔除離群值rs2066362，最終納入28個SNP作為工具變量進行MR分析。IVW結果顯示，AR與過敏性哮喘患病風險有顯著因果關系（OR=69.348，95%CI28.768 ～167.169，P=3.62E-21）。WME和MR-Egger回歸結果也顯示AR與過敏性哮喘患病風險有顯著因果關系（P均＜0.05）。見圖1。

圖1 AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘因果關系的兩樣本MR森林圖

2.2 AR與非過敏性哮喘因果關系分析結果 將AR數據與非過敏性哮喘數據匹配后，最終納入31個SNP作為工具變量進行MR分析。IVW結果顯示，AR與非過敏性哮喘不存在顯著因果關系（OR=2.593，95%CI0.996 ～ 6.752，P=0.051）。WME和MR-Egger回歸結果也顯示AR與非過敏性哮喘患病風險不存在顯著因果關系（P均＞0.05）。見圖1。

2.3 MR分析可靠性評價結果 AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘MR分析過程中，經Cochran′sQ檢驗，各工具變量之間有顯著異質性（P＜0.05）；但MR-Egger截距測試顯示各組截距接近0，且P＞0.05，表明MR分析結果不存在水平多效性，工具變量沒有通過AR以外的其他因素影響過敏性哮喘或非過敏性哮喘的發生，獨立性和排他性假設成立。漏斗圖結果顯示，SNP位點分布基本對稱，表明結果均無明顯異質性，見OSID碼圖1、OSID碼圖2。留一法敏感性分析顯示，無論剔除哪個SNP都不會對分析結果產生根本影響，表明AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘MR分析結果是穩健的，見OSID碼圖3、OSID碼圖4。

3 討論

哮喘是一種常見疾病，哮喘的治療耗費巨大的人力和經濟成本［9-11］。既往研究對AR與哮喘的因果關系尚不明確。本研究中應用兩樣本MR研究方法較為準確地證明AR與過敏性哮喘存在顯著的因果關系，而與非過敏性哮喘不存在顯著的因果關系。通過MR研究方法探討AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間的因果關系，可為不同表型哮喘的預防和治療提供更加清晰的理論支撐，是進一步探究不同表型哮喘病理生理機制的關鍵。鼻炎與哮喘是相互關聯的臨床表型［12］，觀察性研究表明，AR與哮喘發病關系密切，AR是哮喘的危險因素，但無法推斷出AR是哮喘的原因還是后果。如果AR只與部分表型哮喘有因果關系，則需要深入研究評估這部分表型哮喘發生發展過程中AR所發揮的作用，并且需要進一步探討解決AR與不同表型哮喘之間的因果關系與內在機理，為不同表型哮喘的病理生理學機制研究提供方向。

AR是世界上患病率最高的疾病之一，帶來巨大的醫療和社會經濟負擔［13-14］，嚴重影響患者的生活質量［15］。AR是哮喘控制不佳的主要風險因素，多項流行病學和臨床研究表明，AR和哮喘之間存在密切關系，但對他們的內在機制聯系仍不明確［1，16-17］。過敏性哮喘與非過敏性哮喘是哮喘的主要表型，過敏性哮喘的特征包括嗜酸性氣道炎癥、對各種過敏原特異性致敏、總IgE水平和特異性IgE水平升高、血液嗜酸性粒細胞計數增加、呼出一氧化氮水平升高，而非過敏性哮喘沒有這些特征表現，但兩者的共同點都是可逆性氣道阻塞［18］。哮喘合并AR的情況較為常見，應重視哮喘患者過敏原的篩查與AR的防治［19］。AR與哮喘屬于“同一氣道，同一疾病”，是2001年世界衛生組織提出的觀念，與本研究MR分析結果AR與過敏性哮喘有顯著的因果關系相互印證，也與世界變態反應組織提出的過敏性鼻炎—哮喘綜合征這一診斷術語相互印證，但本研究MR分析結果還提示AR與非過敏性哮喘不存在顯著的因果關系，需進一步探討不同表型哮喘與AR之間的潛在聯系和病理生理學機制。

本研究利用MR研究方法探討AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間的因果關系，具有許多傳統流行病學研究方法所不具備的優勢。MR是基于全基因組測序數據、類似于隨機對照研究、能有效減少偏倚、用于揭露因果關系的統計學方法。傳統流行病學研究方法對病因研究存在許多弊端，其中觀察性研究不能人為施加干預措施，只能在自然狀態下判斷想要研究的因素和發生疾病之間的關聯，存在反向因果關系、潛在混雜因素等問題，而實驗性研究如隨機對照試驗需先在動物身上進行實施，通過動物毒理學測試，再逐步開展人體試驗，實施起來困難較大，且須考慮醫學倫理等問題，難以探究疾病的病因。運用MR研究方法從基因學角度探討和判斷AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間的因果關系，具有獨特的優勢。MR分析基因與基因之間的作用，是在基因層面進行研究，不會受到外界環境因素干擾。MR研究基于孟德爾遺傳規律，親代的等位基因隨機分配給子代，此過程相當于隨機對照試驗中的隨機分組過程，不受傳統混雜因素如環境暴露、社會地位、行為等影響，且滿足時間順序的合理性，即遺傳變異繼承來自父母，且保持相對不變。

本研究也存在一定的局限性，異質性檢驗過程中，Cochran′sQ檢驗結果表明有顯著異質性，可能是由于雙樣本的數據存在差異，即來自不同分析平臺、不同實驗及不同人群的SNP可能存在異質性，但這不影響MR分析結果的可靠性。MR分析中利用隨機效應的IVW作為主要結局，存在異質性是可以接受的，且本研究MR分析結果不存在水平多效性，不違背MR核心假設，不影響最終的MR分析結果［20］。另外，GWAS數據年齡跨度可能比較大，疾病嚴重程度也未能有效分層，只能籠統分析，不能進行更加細致的分層分析。因此該研究無法驗證不同性別或年齡層中AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間的因果關系是否是一致的，也不能驗證不同AR嚴重程度與不同表型哮喘之間的因果關系。當后續分層GWAS匯總數據可得時，可進行更加細致的因果關系分析，進一步驗證研究成果。