黃芪桂枝湯對慢性萎縮性胃炎大鼠血清胃泌素、胃動素表達的影響※

安 云 陳偉剛 陳博燊 周 霞 多紅東 李強斌

(廣東省廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院內(nèi)科,廣東 廣州 511400)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是胃的一種癌前病變[1]。在病理上,CAG經(jīng)過胃黏膜的固有腺體減少萎縮、腸上皮細胞化生、不典型增生等過程,進一步發(fā)展成為胃癌。我國CAG轉(zhuǎn)為胃癌的幾率為1.2%～7.1%[2]。CAG病勢纏綿,臨床癥狀多樣,給患者及社會造成了嚴重負擔(dān)。因此,早期發(fā)現(xiàn)、早期治療CAG是阻斷本病進一步癌變發(fā)生的重要方式,同時也對改善患者生活質(zhì)量大有裨益[3]。黃芪桂枝湯是在《金匱要略》桂枝加黃芪湯原方基礎(chǔ)上,加黨參、茯苓、白術(shù)、干姜、烏藥、陳皮和升麻等藥組成,功效調(diào)和營衛(wèi),溫陽健脾,在臨床治療CAG患者取得了良好的臨床療效。本研究采用黃芪桂枝湯治療CAG大鼠,觀察黃芪桂枝湯對CAG大鼠胃黏膜病理改變、胃腸激素等的影響,評估黃芪桂枝湯對CAG的治療價值,為中醫(yī)藥辨治CAG提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠60只,6周齡,體質(zhì)量200～300 g,雄性,購自珠海百試通生物科技有限公司,許可證號:SCXK(粵)2020-0051,動物合格證號:44822700001671,飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,溫度(25±2)℃,濕度50%～60%,12 h/12 h白天黑夜循環(huán),自由飲食和進水。

1.2 藥物及試劑 黃芪桂枝湯藥物組成:黃芪15 g,桂枝10 g,黨參10 g,茯苓15 g,白芍15 g,白術(shù)10 g,甘草6 g,干姜9 g,烏藥10 g,陳皮12 g,升麻6 g,中藥免煎顆粒購自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司,用溫蒸餾水配成相當于原生藥材2 g/mL的濃縮劑;甲基硝基亞硝基胍(MNNG)(廣州康明生物科技有限公司,批號:20210601);鹽酸雷尼替丁膠囊(廣東恒健制藥有限公司,國藥準字H44021173);葉酸片(福州海王福藥制藥公司有限公司,國藥準字H35020215);蘇木素、伊紅染色液(北京索萊寶科技有限公司);胃泌素(GAS)、胃動素(MTL)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(廣州康明生物科技有限公司)。

1.3 實驗儀器 HM340E半自動輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(美國Thermo Fisher公司),Gemini AS自動染色機(美國Thermo Fisher公司),電子分析天平(日本島津公司),Fresco 70冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司),光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)等。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模及分組 60只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。選取50只大鼠采用甲基硝基亞硝基胍(MNNG)綜合法進行造模:自由飲用濃度為180 μg/mL的MNNG溶液,配合0.003 g/mL的鹽酸雷尼替丁灌胃,每3天1次;其余10只大鼠為空白組,予等容積蒸餾水灌胃。造模周期為3個月。每6周從造模大鼠中抽出1只大鼠進行解剖,做病理蘇木素-伊紅(HE)染色切片,觀察其胃黏膜的組織形態(tài)學(xué)變化,當出現(xiàn)胃黏膜固有腺體萎縮、黏膜肌層增厚、腸上皮化生、固有膜炎癥等時提示造模成功。其中,造模期間,空白組大鼠無自然死亡,造模大鼠死亡3只。隨后將造模大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機分為5組:模型組、葉酸組及黃芪桂枝湯高、中、低劑量組。

1.4.2 給藥 空白組及模型組大鼠予10 mL/kg蒸餾水灌胃,葉酸組予5 mg/kg葉酸混懸溶液灌胃,黃芪桂枝湯高、中、低劑量組分別予28 g/kg、14 g/kg、7 g/kg黃芪桂枝湯灌胃,灌胃容積10 mL/kg,每日1次,每周灌胃5天,休息2天。灌胃8周。

1.5 觀察指標及方法 灌胃8周后,各組大鼠禁食水48 h,10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉后取其下腔靜脈血,處死并取胃組織,觀察胃黏膜解剖形態(tài)。

1.5.1 實驗室指標 各大鼠的血液在4 ℃,3500 r/min條件下離心15 min,抽取上層清液,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測GAS、MTL含量。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5.2 病理學(xué)觀察 將大鼠胃組織于甲醛溶液中固定,剪取大小均勻的胃組織,進行脫水處理;脫水后的胃組織于石蠟包埋機包埋、切片機片;切片置于烘箱中烘干2 h;將組織切片按HE染色機設(shè)定程序操作,按程序加入梯度酒精、TO、分化液、HE染液,按程序染色;完成上述程序,將切片于自然條件下晾干,用中性樹膠固封、晾干;在光學(xué)顯微鏡下(×100,×200)觀察胃黏膜組織病理學(xué)改變;參照慢性胃炎病理診斷標準和新悉尼系統(tǒng)的直觀評分法[4]將炎癥、萎縮和腸上皮化生等組織學(xué)變化分為無、輕、中、重度4個級別,分別記0、1、2、3 分。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清GAS、MTL水平比較 與空白組比較,模型組大鼠血清GAS升高(P<0.05),MTL水平降低(P<0.05);與模型組比較,黃芪桂枝湯高、中劑量組大鼠血清GAS水平均降低(P<0.05),葉酸組血清MTL高于模型組(P<0.05);與葉酸組比較,黃芪桂枝湯高、中、低劑量組血清GAS、MTL水平均改善,但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);黃芪桂枝湯高、中、低劑量組間血清GAS、MTL水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清GAS、MTL水平比較

2.2 各組大鼠胃組織形態(tài)學(xué)觀察 空白組大鼠胃黏膜光滑紅潤、黏液較多;模型組大鼠胃黏膜上遍布疣狀突起、增生,黏膜暗沉泛白;葉酸組大鼠與模型組大鼠胃黏膜相比有所改善,多單粒增生;各中藥組大鼠增生突起少,且呈單粒分布,黏膜較紅潤,其中黃芪桂枝湯高、中劑量組大鼠的胃黏膜較光滑紅潤、彈性較好,疣狀突起、增生較少。見圖1。

圖1 各組大鼠胃組織形態(tài)學(xué)觀察

2.3 各組大鼠胃黏膜病理學(xué)觀察 空白組大鼠胃黏膜上皮柱狀細胞完整,黏膜肌層排列呈內(nèi)環(huán)外縱,細胞核分布有序;而模型組大鼠黏膜肌層出現(xiàn)炎性浸潤,排列較紊亂;葉酸組大鼠胃黏膜上皮柱狀細胞核散在,排列不緊密;黃芪桂枝湯高、中、低劑量組胃黏膜肌層炎性浸潤情況與模型組相比呈減輕態(tài)勢。見圖2。

圖2 各組大鼠胃黏膜病理圖(HE染色,×100、×200)

2.4 各組大鼠胃黏膜大體及鏡下病理評分比較 與空白組比較,模型組大鼠胃黏膜大體及鏡下病理評分均升高(P<0.05);與模型組比較,葉酸組及黃芪桂枝湯高、中、低劑量組胃黏膜大體及鏡下病理評分均降低(P<0.05)。葉酸組與黃芪桂枝湯高、中、低劑量組間各評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠胃黏膜大體及鏡下病理評分比較 分,

3 討論

CAG目前被認為是胃的一種癌前病變[5]。在病理上,CAG經(jīng)過胃黏膜的固有腺體減少萎縮、黏膜層變薄、黏膜肌層變厚、腸上皮化生、不典型增生多節(jié)點、多基因的變異積累過程而發(fā)展成胃癌[6]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于CAG的發(fā)病機制尚不清楚,主要有藥物治療和手術(shù)治療兩種方式。藥物治療主要是增強胃腸蠕動功能,促進胃排空,減少胃酸分泌,保護胃黏膜,以及使用抗生素對幽門螺桿菌(Hp)呈陽性CAG進行治療[7-8]。CAG的西藥治療主要為對癥治療,對于逆轉(zhuǎn)CAG的作用有限,且長期服用西藥的不良反應(yīng)大,容易產(chǎn)生耐藥性,嚴重干擾了患者的治療,目前提倡中西醫(yī)結(jié)合治療[9]。在現(xiàn)代臨床中,中藥常被用作治療癌前疾病的輔助藥物。在辨證論治的原則下,通過加減配伍藥方,刺激機體免疫的同時,穩(wěn)定激素水平,并且配伍可以降低用藥毒性,減小副作用,同時起到調(diào)理全身的作用[10]。

在中藥復(fù)方中,如四君子湯加減、參苓白術(shù)散、黃芪建中湯加減、柴芩承氣湯等,可以提高患者免疫力,改善其胃腸道功能[11-13]。黃芪桂枝湯具有調(diào)和營衛(wèi)、溫陽健脾功效,方中黃芪補氣為君;桂枝溫陽,白芍養(yǎng)血止痛,加大棗可調(diào)和營衛(wèi),行陽散邪,為臣藥;佐以茯苓、白術(shù)、陳皮健脾益氣,干姜、烏藥行氣止痛,升麻升脾胃之氣;甘草調(diào)和諸藥,為使藥。全方共奏調(diào)和營衛(wèi)、溫陽健脾之功效。

MTL、GAS的變化充分反映了胃腸功能及消化道癥狀情況[14]。MTL具有調(diào)控消化間期胃腸道移行性復(fù)合運動的作用,可以增加結(jié)腸運動;GAS可促進胃竇收縮,促進胃黏膜的生長,促進胃蛋白酶和胃酸分泌,也可引起胃底舒張和胃竇收縮,提高幽門泵的活動,促進胃排空[15-17]。本研究結(jié)果顯示,黃芪桂枝湯高、中劑量組對CAG大鼠血清GAS、MTL水平的改善作用較佳。黃芪桂枝湯高、中、低劑量組的大鼠GAS含量與模型組相比均減少,但葉酸組大鼠GAS含量甚至高于模型組。黃芪桂枝湯高、中劑量組和葉酸均具有升高CAG大鼠血清MTL含量的作用。

各組大鼠胃組織形態(tài)顯示,模型組大鼠胃黏膜出現(xiàn)大量增生、疣狀突起成片,黏膜泛白、暗沉、略有糜爛等現(xiàn)象。經(jīng)給藥治療后,黃芪桂枝湯高、中劑量組大鼠的胃黏膜上增生有明顯的減少,突起多呈單個,黏膜也較模型組紅潤;而陽性藥葉酸組和黃芪桂枝湯低劑量組的治療效果稍差,黏膜上增生較多。經(jīng)過HE染色處理并對組織病理切片進行分析,模型組大鼠存在炎性因子浸潤、黏膜上皮細胞排列紊亂等,經(jīng)中藥給藥后有一定的改善。根據(jù)各組大鼠的病理圖分析及評分,各給藥組大鼠與模型組相比胃組織損傷有不同程度的改善,其中黃芪桂枝湯高、中劑量組的病理評分較低,對應(yīng)受損傷的程度較小,這可能是黃芪桂枝湯對胃黏膜具有損傷修復(fù)的作用。

綜上所述,黃芪桂枝湯可有效預(yù)防CAG的進展,可以減少血清GAS中濃度、增加MLT濃度,改善胃腸運動,起到改善CAG大鼠胃黏膜病理狀態(tài),為CAG的防治提供實驗依據(jù)。