新疆石河子市漢維兩族學齡前兒童口腔菌群多樣性

余重慶 沈玉鳳 鄭程東 陳鐸 李東慧 錢藝 張若珍 馬學花 周政

齲病系生物膜介導的、碳水化合物驅使的多因素動態疾病,導致牙體硬組織的周期性脫礦和再礦化[1]。第四次中國口腔健康流行病學報告指出:在中國,5歲兒童的牙齒患齲率為71.9%[2]。對于學齡前兒童(3～5 歲)而言,低齡兒童齲病(early childhood caries,ECC)是危害其健康的常見感染性疾病,世界衛生組織(WHO)將ECC列為重點防治疾病[3-5]。ECC的誘發因素較為復雜,多數學者支持四聯因素學說:細菌、環境、宿主、時間是ECC發生發展的必要因素。其中,細菌作為最主要的因素。如何精準定位細菌是防治ECC的首要任務。

現階段,隨著分子分析方法的出現,使得探索細菌微生物多樣性成為了可能,常用技術有聚合酶鏈反應變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)、人口腔微生物鑒定芯片(HOMIM)以及16S rDNA高通量測序[6-8]。這些方法中,PCR-DGGE和HOMIM適用于分析微生物群落中的主要物種,而16S rDNA測序法則能夠檢測微生物組的全面概況[9]。在我國16S rDNA測序技術已廣泛應用于食品科學,動物科學,環境科學等領域[10-12]。近年來,其在牙科微生物中的應用也越來越多,如牙周炎[13]、低齡兒童齲病[14]和根尖周疾病[15]。

新疆維吾爾自治區漢族和維吾爾族人口數量比例接近1∶1,在石河子市抽選的幼兒園學齡前兒童與該人口比例接近。因此本研究旨在采用16S rDNA測序的方法,探究漢族和維吾爾族有齲和無齲學齡前兒童口腔唾液中細菌菌群的多樣性,為后續研究以及新疆不同民族學齡前兒童齲病的防治提供微生物學理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2021 年10～12 月對石河子市4所幼兒園的學齡前兒童進行口腔流行病學調查,經口腔檢查后納入3～5 歲的漢族和維吾爾族兒童一共54 例參與本研究。

1.1.1 受試者納入標準 所有兒童在檢查前1 個月內未服用抗生素,無系統性疾病、無先天性疾病或其他疾病(口腔黏膜疾病),口腔內未佩戴矯治器。本研究經石河子大學醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會批準(批準號:KJX-2021-084-01)。被檢查的孩子都獲得了家長或監護人允許并簽署知情同意書。

1.1.2 口腔檢查 3 名進行口腔醫學臨床相關工作的醫生對符合納入標準的兒童進行檢查,并記錄乳牙齲失補指數(dmft),檢查器械均為一次性使用口腔器械。在檢查前,所有醫生均接受培訓,檢查醫生之間Kappa值均>0.85。低齡兒童齲病的診斷標準采用的WHO《口腔健康調查基本方法》(第5版)。

1.1.3 具體分組 54 個樣本被分為4 個組:(1)HCF組(漢族學齡前兒童無齲組,dmft=0)15 例;(2)HCA組(漢族學齡前兒童有齲組,dmft≥6)14 例;(3)WCF(維吾爾族學齡前兒童無齲組,dmft=0)13 例;(4)WCA(維吾爾族學齡前兒童有齲組,dmft≥6)12 例。

1.2 樣本采集方法

采樣前,根據已發表的文獻[1]培訓檢查者。2021 年11～12 月上午10～12 點收集樣本,受試者前一天晚上及當日早上不刷牙,采樣前2 h內不進食并輕輕漱口。用5 mL無菌無酶凍存管收集參與者的未刺激唾液1.5 mL,置于-20 ℃的環境中轉運,2 h以內運送到石大一附院口腔科-80 ℃冰箱內保存。

1.3 唾液細菌全基因提取、聚合酶鏈式反應(polymerace chain reaction,PCR)

選取符合條件的學齡前兒童唾液,兒童唾液中提取DNA按照PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories Inc.,CA)【Omega E.Z.N.A Stool DNA Kit(Omega Bio-tek Inc.,USA)】試劑盒說明書。提煉出的DNA通過Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific Inc.,USA)進行DNA質量和濃度檢測。

在ABI 9700 PCR儀(ThermoFisher Scientific,Inc.)上進行擴增。

1.4 測序

使用NEB Next Ultra II DNA Library Prep Kit (New England Biolabs,Inc.,USA)建庫試劑盒完成文庫構建,通過Illumina Miseq PE300(Illumina,Inc.,USA)平臺實現測序。

1.5 數據分析處理

以97%為一致性對序列進行操作分類單元(operational taxomomic units,OTUs)聚類分析,用Silva138數據庫進行物種注釋分析。通過聚類分析共獲得1 350 個OTUs,注釋到27 個門和357 個屬。

計算α多樣性,包括Shannon指數、Chao1指數、Observed species(OTU count)指數以及Phylogenetic(PD whole tree)指數。進行物種組成柱狀圖分析。計算β多樣性,使用基于Bray-Curtis的主坐標分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)以及基于OTU的偏最小二乘法判別分析(Partial Least Squares Discrimination Analysis,PLS-DA)。

2 結 果

2.1 測序信息

54 個樣本被分為4 個組,所有樣本通過Illumina平臺測序后,一共有2 867 526 條優質序列來自54 個樣本,平均每個樣本有53 102 條序列。

4 個組所有樣本包含1 350 個OTUs(operational taxonomic units):其中HCF和WCF組樣本共有OTUs數975 個;HCA組和WCA組樣本共有OTUs數800 個;HCF組和HCA組樣本共有970 個OTUs;WCA和WCF組樣本共有801 個OTUs。HCF組樣本特有OTUs 55個;WCF組樣本特有OTUs 17 個;HCA組樣本特有OTUs 22 個;WCA組樣本特有OTUs 70 個(圖1)。

圖1 不同分組兒童口腔菌群分布韋恩圖

2.2 門水平上物種相對豐度

在門水平選取豐度排名最高的5 個物種,分別為硬壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、變形細菌門(Proteobacteria)、梭菌門(Fusobacteriota)、放線菌門(Actinobacteriota)等,生成物種豐度柱形圖(圖2)。HCA組與HCF組相比:擬桿菌門和梭菌門物種相對豐度較高,硬壁菌門和變形菌門物種相對豐度較低。WCA組與WCF組相比:硬壁菌門物種相對豐度較低,擬桿菌門物種相對豐度較高。HCF組與WCF組相比:硬壁菌門物種相對豐度較低而變形細菌門豐度較高。HCA組和WCA組相比:擬桿菌門相對豐度較高而變形細菌門豐度較低。

圖2 門水平物種相對豐度柱形圖

2.3 屬水平上物種相對豐度

在屬水平選取豐度排名最高的物種,生成物種豐度柱形圖(圖3)。HCA組和WCA組相比:普氏菌屬(Prevotella),韋榮球菌屬(Veillonella)和擬普氏菌屬(Alloprevotella)相對豐度較高,鏈球菌屬(Streptococcus)和奈瑟菌屬(Neisseria)相對豐度較低。HCF組和WCF組相比:鏈球菌屬相對豐度較低而奈瑟菌屬相對豐度較高。HCA組和HCF組相比:普氏菌屬、韋榮球菌屬相對豐度較高,鏈球菌屬相對豐度較低。WCA組和WCF組相比:普氏菌屬及嗜血桿菌屬(Haemophilus)相對豐度較高,鏈球菌屬相對豐度較低。

圖3 屬水平物種相對豐度柱形圖

2.4 唾液菌群α多樣性分析

α多樣性是群落生態學中微生物多樣性分析,反映微生物群落的分布與差異[16]。

圖4可見,HCF組的Chao1指數,PD whole tree指數,Observed species指數均高于WCA組(P<0.01);WCA組的Chao1指數和PD whole tree指數均低于WCF組(P<0.05)。HCA組與其他組相比α多樣性指數有差異但不具有統計學意義(P>0.05)。

圖4 唾液菌群α多樣性分析

2.5 唾液菌群β多樣性分析

β多樣性是對不同樣本間的微生物群落構成進行比較。

主坐標分析即PCoA分析,是一種用于研究樣本群落組成的相似性或相異性的統計分析方法。不同分組樣本由不同符號代表,樣本之間距離越近說明他們之間的微生物群落結構越相似。由PCoA分析圖可見WCF,WCA,HCF,HCA組唾液樣本存在著明顯的重疊,意味著不同分組學齡前兒童唾液中微生物組成相似(圖5)。

圖5 基于Bray-Curtis的主坐標分析圖

PLS-DA是一種用于判別分析的多變量統計分析方法。由PLS-DA分析可以看出同一分組內有部分樣本與其他分組重疊,另外一部分呈現出分散的趨勢,意味著不同分組間部分兒童唾液中菌群結構存在相似性(圖6)。

圖6 基于OTU的PLS-DA圖

3 討 論

在新疆少數民族中,維吾爾族人口最多,人員分布最廣。他們有著特殊的飲食習慣,生活環境和遺傳學特征[17],對于漢維兩族學齡前兒童而言,他們對于齲病的認知還沒有完全形成,因此對其父母的健康宣教以及其他有效的干預措施是必要的。本研究中,通過16S rDNA基因測序的方法探索漢維兩族有齲和無齲學齡前兒童口腔唾液內菌群分布差異。可以在微生物層面為兩族學齡前兒童提供個性化預防。由韋恩圖可以看出,不同民族有齲和無齲的學齡前兒童存在共有的OTUs和特有的的OTUs。

在門水平上,漢族患齲兒童和無齲兒童相比:擬桿菌門相對豐度較高,硬壁菌門、變形菌門相對豐度較低。維吾爾族患齲兒童和無齲兒童相比:硬壁菌門相對豐度較低,擬桿菌門相對豐度較高。在屬水平上,漢族患齲兒童和無齲兒童相比:普氏菌屬和韋榮球菌屬相對豐度較高,鏈球菌屬相對豐度較低。維吾爾族患齲兒童和無齲兒童相比:普氏菌屬和嗜血桿菌屬相對豐度較高,鏈球菌屬相對豐度較低。因此在本研究中,對于同一民族兒童而言,患齲狀態下口腔唾液內擬桿菌門豐度高于無齲狀態而厚壁菌門豐度低于無齲狀態。患齲兒童唾液中普氏菌屬相對豐度較高而鏈球菌屬相對豐度較低。此次研究結果發現兒童唾液中細菌物種相對豐度存在動態平衡,并未發現ECC特異性致病菌,即并未發現只存在于患齲兒童或無齲兒童口腔唾液中的細菌,這與之前的研究結果[18]一致。

根據唾液菌群α多樣性分析,維吾爾族學齡前無齲兒童唾液樣本中Chao1指數高于患齲兒童(P<0.05),表明其唾液中細菌群落豐富度較高,物種較豐富。同樣人群唾液中的PD whole tree指數也高于患齲兒童(P<0.05),說明在本研究維吾爾族學齡前兒童中,與患齲兒童相比,無齲兒童唾液中菌群多樣性更高。對于漢族無齲兒童而言,無齲兒童的Chao1指數,PD whole tree指數,Observed species指數以及Shannon指數均高于對應的患齲兒童,但其差異均不具有統計學意義(P>0.05),表明無論漢族學齡前兒童是否患齲,其口腔唾液中菌群物種多樣性及豐富度均無明顯差異。與Jiang等[9]的研究結果一致。根據唾液菌群β多樣性分析,PCoA分析和PLS-DA分析均表明在不同分組中,學齡前兒童的唾液菌群仍然存在著一定的相似性,意味著不論是不同民族還是患齲或無齲狀態,學齡前兒童唾液中的菌群結構都會有所重疊。這與之前的研究結果一致[14]。后續的研究可以從患齲兒童齲洞中收集樣本,從而更加深入地探討齲病與口腔內微生物之間的關系。

Gomez等[19]的研究發現口腔微生物結構易受宿主基因、飲食影響。而漢族和維吾爾族在飲食結構,生活習慣和遺傳學上有著顯著差異,后續的研究應該著重于不同飲食結構、不同生活環境以及基因層面上的研究。人類口腔內微生物在人體健康中扮演著重要角色[20-22],本研究中的結果說明齲病的發生發展并非是預期的出現某種特異性致病菌的簡單過程。事實上,人口腔中微生物和宿主相互協調,達到一個“共生”的狀態,一旦平衡被打破,口腔微生物群落失衡,會引起一系列口腔疾病甚至波及全身[23-24]。

值得關注的是,本次研究結果發現維吾爾族學齡前兒童有齲組普氏菌屬物種相對豐度高于無齲組,Qudeimat等[25]也發現其在患齲組學齡前兒童中占據顯著地位,與本研究結果一致,但目前還沒有針對普氏菌屬和低齡兒童齲病的縱向研究。因此,普氏菌屬可以作為下一步研究的重點菌群。本課題組也將對此次納入的研究對象進行定期的隨訪,時間周期為3個月,旨在探索普氏菌屬在漢族和維吾爾族學齡前兒童齲齒發病進展中的詳細作用。

綜上所述,本研究對于不同民族有齲和無齲學齡前兒童口腔唾液中菌群多樣性進行了初步探索,確認了維吾爾族學齡前兒童在齲病發生發展過程中唾液內菌群多樣性減少,為新疆維吾爾族兒童齲病相關的防治在微生物層面提供了參考,對于漢族學齡前兒童,由于本研究納入的樣本量不夠大,結合漢族兒童復雜的飲食結構、生長環境以及遺傳學特點,尚不能確認漢族學齡前兒童在齲齒發病過程中唾液內菌群變化情況。還需要采取更尖端的技術,更龐大樣本數量來探索不同民族學齡前兒童口腔唾液中微生物群落的變化。