補(bǔ)腎壯骨方通過EphB4/Ephrin-B2 軸緩解絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松

吳志明 袁振興 勒春 曹正柳 萬欣 周易芬 張鵬 （.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科 南昌 0000；.九江市第六人民醫(yī)院中醫(yī)科 江西 九江 000；.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科 南昌 0000）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis,PMO）主要表現(xiàn)為絕經(jīng)后老年女性骨量減少，骨結(jié)構(gòu)變化引起髖關(guān)節(jié)及椎體壓縮性骨折等［1-2］。PMO使老年人骨折風(fēng)險﹑致殘風(fēng)險及死亡率顯著升高，增加公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)［3］。雌激素替代療法是預(yù)防和治療PMO 進(jìn)展和降低骨折風(fēng)險的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)經(jīng)典的治療方法［4］。然而，雌激素替代療法可能導(dǎo)致乳腺癌﹑婦科腫瘤及冠心病等心血管疾病的發(fā)生［5］。因此，急需尋找療效較佳﹑副作用較小的天然替代品預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松引起的骨質(zhì)流失和骨折風(fēng)險。補(bǔ)腎壯骨方組成為生地黃15 g，知母15 g，補(bǔ)骨脂12 g，巴戟天12 g，淫羊藿15 g，枸杞子12 g，酸棗仁10 g，黃柏10 g,具有補(bǔ)腎寧心，燮理陰陽的功能。其不僅能有效地改善圍絕經(jīng)期婦女的神經(jīng)癥狀，同時對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有良好的防治作用。預(yù)試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)圍絕經(jīng)期婦女在口服補(bǔ)腎壯骨方后，外周血雌激素（estrogen 2，E2）水平無明顯變化，Th 細(xì)胞比例顯著增加。本實驗通過ELISA 分析補(bǔ)腎壯骨方對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型性激素水平及骨生化指標(biāo)的影響，Western blot 分析補(bǔ)腎壯骨方對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞EphB4﹑Ephrin-B2 蛋白表達(dá)的影響，Micro-CT 成像檢測體內(nèi)骨密度及骨小梁參數(shù)，進(jìn)一步闡明該復(fù)方防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的療效與作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物與試劑

補(bǔ)腎壯骨方：江西省國醫(yī)名師曹正柳創(chuàng)立，包含生地黃15 g， 知母15 g，補(bǔ)骨脂12 g，巴戟天12 g，淫羊藿15 g，枸杞子12 g，酸棗仁10 g，黃柏10 g。此方劑中所有中藥飲片均由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，按照每100 g 中藥飲片配比800 mL 飲用水，按常規(guī)煎煮方法進(jìn)行制備。其后，進(jìn)行過濾濃縮至生藥2.5 g/mL，成品儲存于4 ℃恒溫冰箱之中。雌激素組采用戊酸雌二醇片（補(bǔ)佳樂，拜耳醫(yī)藥上海有限公司，批號J20171038），成人日用量1 mg，換算成小鼠為每天0.13 mg/kg，小鼠每天灌胃容量為0.10 mL/10 g，雌二醇溶液含藥量為0.013 mg/mL，配制好后置于4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩2﹑FSH﹑LH 性激素ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，貨號1530503688﹑1533849327﹑1533697166）；Ca﹑P﹑ALP 骨生化指標(biāo)試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，貨號1529396445﹑1535598798﹑TE0009）；EphB4 抗體﹑Ephrin-B2 抗體﹑GAPDH 抗體（英國Abcam 公司，貨號xy50582-R039﹑Hz-10659R﹑ab9484）。

1.2 主要儀器

170/3940 型轉(zhuǎn)膜儀（英國伯樂公司）；PVDF膜（美國Millipore 公司）；超凈工作臺（蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司）；萬分之一分析天平（上海精科儀器有限公司 )；自動平衡離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；超低溫冰箱（德國賀利氏公司）；微量移液器（德國Gilson 公司）；Micro-CT系統(tǒng)（德國Siemens AG 公司）；雙能X 骨密度儀（美國 Hologic 公司）。

1.3 動物

清潔級雌性 BALB/c 小鼠50 只，12~13 月齡，體重（21.51±1.20）g，購自南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心，合格證號：SYXK（贛）2021-0003。實驗期間，小鼠給予常規(guī)喂養(yǎng)，自由進(jìn)食﹑飲水，動物房內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定室溫保持在22~26 ℃，相對濕度保持在40%~60%，保持良好的通風(fēng)。本研究涉及的動物實驗經(jīng)過南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理編號：（2021）醫(yī)研倫審第（9-006）號。

1.4 分組及模型建立

實驗小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為5 組，分別為正常對照組﹑假手術(shù)對照組﹑去勢手術(shù)組﹑補(bǔ)腎壯骨方組﹑雌激素組。去勢手術(shù)組給予雌性BALB/c小鼠氯胺酮100 mg/kg 麻醉，之后經(jīng)背部入腹切除雙側(cè)卵巢；假手術(shù)組在卵巢附近切除與卵巢質(zhì)量大致相等的脂肪組織，不對卵巢做任何處理；灌藥6 周后，從正常對照組﹑假手術(shù)對照組及去勢手術(shù)組隨機(jī)取2 只置于雙能X 線吸收測量儀平臺上測定股骨骨密度（BMD），根據(jù) BMD 含量判斷是否造模成功。

1.5 給藥方法及劑量

正常對照組：正常喂食，按0.10 mL/10 g 體重灌服生理鹽水，每日1 次，連續(xù)灌胃12 周。假手術(shù)對照組：按0.10 mL/10 g 體重灌服生理鹽水，每日1 次，連續(xù)灌胃12 周。去勢手術(shù)組：去勢手術(shù)造模成功后，按每天0.10 mL/10 g 灌服生理鹽水，每日1 次，連續(xù)灌胃12 周。補(bǔ)腎壯骨方組：去勢手術(shù)造模成功后，按0.10 mL/10 g 體重灌服補(bǔ)腎壯骨方，每日1 次，連續(xù)灌胃給藥12 周。雌激素組：去勢手術(shù)造模成功后，雌激素組按含藥量0.013 mg/mL相應(yīng)溶液0.1 mL/10 g 灌胃，每日1 次，連續(xù)灌胃給藥12 周。

1.6 標(biāo)本的采集與處理

各組小鼠末次給藥24 h 后，小鼠稱重，用氯胺酮100 mg/kg 對各組小鼠進(jìn)行麻醉，麻醉狀態(tài)下通過摘眼球取血，所取全血置于室溫下2 h，以3 000 r/min 離心20 min，分離血清，采用ELISA法檢測血清性激素及骨生化指標(biāo)。取血結(jié)束后脫頸處死小鼠，酒精浸泡消毒后完整取出雙側(cè)股骨。

1.7 實驗檢測指標(biāo)及方法

1.7.1 ELISA 檢測血清E2﹑FSH﹑LH 性激素及Ca﹑P﹑ALP 骨生化指標(biāo) 各組小鼠采集全血后進(jìn)行提取血清，保存于-80 ℃低溫冰箱備用。ELISA 實驗操作依照廠家說明書，最后分別計算E2﹑FSH﹑LH性激素及Ca﹑P﹑ALP 骨生化指標(biāo)的血清濃度。

1.7.2 Western blot 檢測骨組織中EphB4﹑Ephrin-B2蛋白表達(dá) 分別收集各組小鼠右側(cè)股骨組織，置于預(yù)冷的生理鹽水中，剔除骨外膜，用蒸餾水清洗干凈血液等雜質(zhì)，之后剪碎骨組織進(jìn)行稱重，后將碎骨放入裝有液氮的研缽中研磨成粉末狀。研磨完成后放入離心管中，每100 mg 骨粉末加入300 μL 蛋白提取試劑，輕輕混勻，冰浴30 min，每5 min 用漩渦混合儀振蕩20 s。最后在12 000 r/min轉(zhuǎn)速條件下離心15 min，所得上清液為骨組織總蛋白。蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，將膜放入封閉液中，用TBST 稀釋脫脂牛奶至濃度為5%，室溫下脫色及封閉60 min，加入所需EphB4﹑Ephrin-B2 一抗和二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)。以GAPDH 作為參照進(jìn)行實驗指標(biāo)檢測。

1.7.3 Micro-CT 檢測骨密度和骨結(jié)構(gòu)參數(shù) 各組小鼠處死后，迅速取小鼠左側(cè)股骨，去除附著的軟組織，將骨組織固定在4%多聚甲醛溶液中。將股骨標(biāo)本置于標(biāo)本杯中固定，采用體外Micro-CT 斷層掃描技術(shù)對股骨骨密度﹑骨結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描。掃描條件設(shè)置為電壓70 kV，掃描電流200 μA，層間距14.80 μm，平面分辨率300 ms，連續(xù)掃描約808 層。檢測骨密度（BMD）﹑骨體積/ 總體積（BV/TV）﹑小梁骨數(shù)目（Tb.N）和小梁厚度（Tb.Th）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，每組間用單因素方差分析，以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重的比較

實驗開始前及第6 周各組小鼠的體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)意義，12 周后去勢手術(shù)組﹑雌激素組小鼠體重均高于正常對照組﹑假手術(shù)對照組及補(bǔ)腎壯骨方組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組小鼠不同時間點體重變化（，n=10） g

表1 各組小鼠不同時間點體重變化（，n=10） g

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與假手術(shù)對照組比，▲P<0.05；與去勢手術(shù)組比較，＃P<0.05。

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2.2 各組小鼠血清性激素水平的比較

去勢手術(shù)組小鼠FSH﹑LH 水平明顯高于正常對照組﹑假手術(shù)對照組﹑補(bǔ)腎壯骨方組及雌激素組，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；去勢手術(shù)組小鼠血清E2水平低于其他4 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；雌激素組E2水平高于正常對照組﹑假手術(shù)對照組﹑補(bǔ)腎壯骨方及去勢手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清E2、FSH、LH含量的比較（，n=10）

表2 各組大鼠血清E2、FSH、LH含量的比較（，n=10）

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與假手術(shù)對照組比，▲P<0.05；與去勢手術(shù)組比較，＃P<0.05。

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2.3 各組小鼠血清骨生化指標(biāo)的比較

去勢手術(shù)組小鼠血清ALP 明顯高于正常對照組﹑假手術(shù)對照組﹑補(bǔ)腎壯骨方組及雌激素組，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；去勢手術(shù)組小鼠血清Ca﹑P 含量明顯低于其他4 組（P<0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血清骨生化指標(biāo)的比較（，n=10）

表3 各組小鼠血清骨生化指標(biāo)的比較（，n=10）

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與假手術(shù)對照組比，▲P<0.05；與去勢手術(shù)組比較，＃P<0.05。

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2.4 補(bǔ)腎壯骨方對各組小鼠BMD 及骨參數(shù)的影響

去勢手術(shù)組小鼠BMD﹑BV/TV﹑Tb.Th 低于正常對照組﹑假手術(shù)對照組﹑補(bǔ)腎壯骨方組及雌激素組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），補(bǔ)腎壯骨方組與雌激素組中BMD﹑BV/TV 低于正常對照組與假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。各組小鼠Tb.N 比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05） 。見表4。

表4 各組小鼠骨密度參數(shù)和骨結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較（，n=10）

表4 各組小鼠骨密度參數(shù)和骨結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較（，n=10）

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與假手術(shù)對照組比，▲P<0.05；與去勢手術(shù)組比較，＃P<0.05。

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2.5 各組小鼠EphB4、Ephrin-B2 蛋白水平

Western blot 檢測提示，EphB4 蛋白表達(dá)在去勢手術(shù)組中低于正常對照組﹑假手術(shù)對照組﹑補(bǔ)腎壯骨方組及雌激素組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），補(bǔ)腎壯骨方組與雌激素組低于正常對照組與假手術(shù)對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；Ephrin-B2 蛋白表達(dá)在去勢手術(shù)組顯著高于其他4 組，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），補(bǔ)腎壯骨方組與雌激素組高于正常對照組與假手術(shù)對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表5﹑圖1。

圖1 各組小鼠EphB4、Ephrin-B2蛋白表達(dá)情況

表5 各組小鼠EphB4、Ephrin-B2蛋白水平（，n=10）

表5 各組小鼠EphB4、Ephrin-B2蛋白水平（，n=10）

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與假手術(shù)對照組比，▲P<0.05；與去勢手術(shù)組比較，＃P<0.05。

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3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種累及全身的代謝性疾病，表現(xiàn)為骨組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化，導(dǎo)致骨組織脆性增加，骨量減少［6］。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是臨床中常見的一種骨質(zhì)疏松癥，對絕經(jīng)后婦女造成巨大影響。此外，研究發(fā)現(xiàn)大約80%的骨折與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)，即使骨折經(jīng)過治療后愈合，患者生活質(zhì)量亦受較大影響［7-8］。成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）和破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）在維持骨量和骨強(qiáng)度過程中起到非常重要的作用，不斷更新骨基質(zhì)，OC 將舊骨或受損骨移除，并由OB 形成新骨，這一高度協(xié)調(diào)的過程被稱為骨重塑［9］。骨重塑障礙是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的常見原因［10］。在OB 和OC 維持的骨代謝平衡中，OB 起著非常重要的作用，而目前應(yīng)用的經(jīng)典抗骨質(zhì)疏松藥物（降鈣素﹑二磷酸鹽﹑雌激素等），多為抑制OC 活性的藥物，缺乏刺激OB 活性或既刺激OB 又抑制OC 的藥物。因此，在深入研究和發(fā)掘化學(xué)合成藥物時，應(yīng)注重中藥的開發(fā)應(yīng)用［11］。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)卵巢切除后的去勢手術(shù)組小鼠體重高于正常對照組﹑假手術(shù)對照組及補(bǔ)腎壯骨方組，給予補(bǔ)腎壯骨方處理的卵巢切除的小鼠體重增加不明顯，低于雌激素組及去勢手術(shù)組，提示補(bǔ)腎壯骨方治療絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松時無雌激素樣增加體重的副反應(yīng)。針對補(bǔ)腎壯骨方對小鼠血清性激素及骨生化指標(biāo)的影響發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎壯骨方不增加性激素FSH﹑LH 與骨生化指標(biāo)ALP 水平，能夠提高卵巢切除術(shù)后小鼠性激素E2及骨生化Ca﹑P 水平，血清Ca﹑P 水平能夠間接反映骨代謝情況。眾所周知，骨重塑的過程是動態(tài)的，維持骨量和骨質(zhì)量，限制過度礦化的骨在體內(nèi)的積累，并通過釋放Ca 和P 的儲備保持礦物質(zhì)的平衡。當(dāng)血液中的Ca含量下降時，甲狀旁腺激素分泌增加，導(dǎo)致骨質(zhì)中的Ca 進(jìn)入血液中，引起骨質(zhì)疏松。提示補(bǔ)腎壯骨方治療絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松時無明顯雌激素樣副反應(yīng)，具有較好臨床應(yīng)用前景。

骨密度是目前公認(rèn)的用于評估骨質(zhì)疏松嚴(yán)重程度及治療療效的一項非常重要的檢測指標(biāo)［12-13］。骨質(zhì)疏松癥表現(xiàn)為骨重塑障礙，骨轉(zhuǎn)換率增加，BMD 和骨結(jié)構(gòu)參數(shù)BV/TV﹑Tb.N 和Tb.Th 等降低。本研究發(fā)現(xiàn)去勢手術(shù)組小鼠BMD﹑BV/TV﹑Tb.Th顯著低于正常對照組﹑假手術(shù)對照組﹑補(bǔ)腎壯骨方組及雌激素組（P<0.05），補(bǔ)腎壯骨方能夠改善卵巢切除后導(dǎo)致的BMD﹑BV/TV﹑Tb.Th 下降，改善去卵巢引起的骨質(zhì)疏松癥。因給予藥物干預(yù)時間較短，補(bǔ)腎壯骨方組與雌激素組中BMD﹑BV/TV低于正常對照組與假手術(shù)組，持續(xù)更長時間使用補(bǔ)腎壯骨方BMD﹑BV/TV 可能會漸接近正常值。

Eph 受體家族是酪氨酸蛋白激酶受體最常見的亞家族，它的配體是Ephrin 家族的蛋白質(zhì)，分為A和B 兩種類型［14］。成骨細(xì)胞膜上的EphB4 受體與破骨細(xì)胞膜的Ephrin-B2 配體結(jié)合抑制破骨細(xì)胞的形成，促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的分化［15］。

研究發(fā)現(xiàn)EphB4/Ephrin-B2 信號通路既有正向信號又有反向信號，呈雙向性，其中反向信號抑制破骨細(xì)胞分化，正向信號調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能和活性［16-17］。研究發(fā)現(xiàn)Ephrin-B2 配體和EphB4受體在成骨細(xì)胞膜上同時表達(dá)，Ephrin-B2 配體在破骨細(xì)胞膜上也有表達(dá)［18-21］。當(dāng)配體與受體結(jié)合時，2 條下游信號通路都被激活。當(dāng)成骨細(xì)胞膜上EphB4 受體與破骨細(xì)胞膜上Ephrin-B2 配體結(jié)合，激活下游信號通路，抑制破骨細(xì)胞的成熟，這被稱為“反向信號”。相反，當(dāng)Ephrin-B2 與成骨細(xì)胞膜上的EphB4 結(jié)合時，會促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化，這被稱為“正向信號”［22］。根據(jù)以往的數(shù)據(jù)，推測補(bǔ)腎壯骨方通過EphB4/Ephrin-B2 軸緩解絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松。

本研究發(fā)現(xiàn)EphB4 蛋白表達(dá)在去勢手術(shù)組顯著低于正常對照組﹑假手術(shù)對照組﹑補(bǔ)腎壯骨方組及雌激素組，提示補(bǔ)腎壯骨方可提高成骨細(xì)胞膜上EphB4 蛋白表達(dá)；Ephrin-B2 蛋白表達(dá)在去勢手術(shù)組顯著高于其他4 組，補(bǔ)腎壯骨方組與雌激素組高于正常對照組與假手術(shù)對照組，提示補(bǔ)腎壯骨方可能抑制成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞膜上Ephrin-B2蛋白表達(dá)。

綜上所述，補(bǔ)腎壯骨方治療絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松臨床效果顯著且無明顯增加體重副反應(yīng)，其能夠升高血清E2水平，降低FSH﹑LH 水平，增加EphB4蛋白表達(dá)，抑制Ephrin-B2 蛋白表達(dá)，無雌激素樣副反應(yīng)，提示其可能通過EphB4/Ephrin-B2 軸緩解絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，為臨床治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供理論依據(jù)。