DNA 甲基化年齡推斷模型在華東漢族人群中的跨平臺應用

王紫薇，李成濤，劉希玲

1.蘇州大學基礎醫學與生物科學學院法醫學系，江蘇 蘇州 215123；2.司法鑒定科學研究院 上海市法醫學重點實驗室 司法部司法鑒定重點實驗室 上海市司法鑒定專業技術服務平臺，上海 200063

DNA 甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾形式，主要是指基因組DNA 上的胞嘧啶C-5 號碳原子在DNA 甲基轉移酶的作用下，以共價鍵結合的方式獲得一個甲基基團，從而形成5-甲基胞嘧啶的化學修飾過程。DNA 甲基化在動、植物基因組中廣泛存在，可隨DNA 復制遺傳給子代，且其修飾模式對基因調控、轉座子沉默及基因印記至關重要[1-3]。

研究[4-7]表明，個體年齡與DNA 甲基化水平顯著相關。這類與年齡相關的DNA 甲基化位點被稱為年齡相關甲基化位點（age-related CpG site，AR-CpG）。通過對AR-CpG 甲基化水平的測定可實現對個體年齡的推斷，其預測精度較高，因而具有較高的法醫學應用價值[8]。國內學者針對中國漢族人群也開展了一些探索性研究并構建了相應的DNA 甲基化年齡推斷模型[9-13]，其中PAN 等[11]研究構建的模型年齡覆蓋范圍較廣且精度較高。

目前絕大多數DNA 甲基化檢測方法都是在亞硫酸氫鹽處理基因組DNA 的基礎上進行的，其基本原理是將非甲基化的胞嘧啶脫氨基轉化為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不受影響，在后續PCR 過程中將尿嘧啶轉化為胸腺嘧啶，繼而將化學修飾差異轉化為序列差異信息。相較于PAN 等[11]所用的多重甲基化SNaPshot 技術，焦磷酸測序通過酶級聯化學發光反應可對單個CpG 位點的甲基化程度同時進行定性和定量分析，其精確度和可重復性相對較高且檢測周期短[14]。目前已有商業化試劑盒能夠完成焦磷酸測序，且從亞硫酸氫鹽轉化的DNA 起始量到上樣量的靈敏性、穩定性均有研究[15-16]。除此之外，隨著高通量測序技術的發展，多重目的區域甲基化富集測序技術可以獲得目標區域內所有甲基化胞嘧啶的甲基化數據，能精確計算甲基化程度且可同時對大量樣本進行多區域DNA 甲基化水平的并行檢測和分析[17]。

已有DNA 甲基化年齡推斷模型大多依托單一檢測技術或單一人群構建，對于其是否適用于其他檢測技術或其他人群仍需進一步研究。為了探討PAN等[11]開發的DNA 甲基化年齡推斷模型在中國華東漢族人群中的可重復性以及是否適用于焦磷酸測序和多重目的區域甲基化富集測序平臺，本研究基于該模型[11]中包含的AR-CpG 位點，使用焦磷酸測序和基于下一代測序（next-generation sequencing，NGS）的多重目的區域甲基化富集測序技術在中國華東漢族人群中進行檢測，評估該模型在不同人群以及不同技術平臺中的年齡推斷效率，探索血液年齡推斷模型在不同DNA 甲基化檢測技術下用于法醫學年齡推斷的適用性。

1 材料與方法

1.1 樣本

本研究實驗對象來自中國華東地區48 例漢族無關個體，其中男性24 例，女性24 例，年齡覆蓋范圍為3～86 歲且年齡分布均勻（表1）。志愿者本人或其監護人均在采集外周血樣本前簽署知情同意書。以上樣本的采集和使用均已獲得司法鑒定科學研究院倫理委員會批準（審批號2022-5）。

表1 48 例樣本的年齡和性別組成Tab.1 Age and gender composition of the 48 samples（例）

1.2 DNA 提取與定量

使用QIAamp?DNA Blood Mini 試劑盒（德國Qiagen 公司），參照試劑盒操作說明對48 例外周血樣本進行DNA 提取，使用Qubit?2.0 熒光計、Qubit?ds-DNA HS Assay 試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）對DNA 進行定量。

1.3 亞硫酸氫鹽轉化DNA

使用EpiTect Fast Bisulfite 試劑盒（德國Qiagen公司），參照操作說明以每例樣本400 ng 的DNA 為起始量進行亞硫酸氫鹽轉化，得到轉化后的DNA 溶液，并使用QubitTMssDNA 檢測試劑盒（美國Invitrogen 公司）進行濃度測定，置于-20 ℃條件下保存。

1.4 引物設計及PCR 擴增

參考文獻[11]中選取的6 個甲基化位點，使用Pyro-Mark Assay Design 2.0 軟件（德國Qiagen 公司）對位點進行引物設計。CpG 位點及引物信息如表2 所示。按照PyroMark PCR 試劑盒（德國Qiagen 公司）操作說明，以10 ng 轉化后的DNA 為起始量進行PCR 擴增：95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環45 次；72 ℃ 10 min。

表2 6 個AR-CpG 的引物信息Tab.2 Primer information of 6 AR-CpG

1.5 焦磷酸測序

基于焦磷酸測序數據，對同一個樣本的6 對引物進行3 次重復實驗。在PyroMark?Q48 自動焦磷酸測序軟件（德國Qiagen 公司）上進行程序設置，包括測序序列的生成和測序樣本的相關信息。使用軟件中的內部質量控制設置進行質量控制，并設置3 個重復樣本，按照默認參數進行甲基化位點分析。將10 μL PCR 產物、測序引物和測序用試劑PyroMark?Q48 Advanced CpG Reagents（德國Qiagen 公司）按照儀器操作提示分別加入PyroMark?Q48（德國Qiagen 公司）中，待程序運行結束，導出測序結果。將焦磷酸測序結果文件導入軟件，軟件自動進行CpG 數據分析。導出內含測序峰圖和目的位點的甲基化水平信息的測序結果文件。

1.6 NGS 數據分析

使用1.4 節所得PCR 產物，將同一樣本的多個位點產物混合，利用TruSeq?Nano DNA Library Prep試劑盒（美國Illumina 公司）進行文庫構建，向各個樣本添加特異性分子標簽，再將所有樣本進行混合，接著進行文庫瓊脂糖凝膠純化回收，經過文庫質量檢驗和定量后，進行樣本混合，在NovaSeq 6000 測序系統（美國Illumina 公司）上采用單端150 bp 測序模式進行文庫測序。測序數據使用TrimGalore v0.6.1 軟件（https：//github.com/FelixKrueger/TrimGalore/releases）進行質量控制并去除測序接頭序列。經過質量控制后的測序數據通過Bismark v0.23.1 軟件（https：//github.com/FelixKrueger/Bismark/releases）比對到“bismark genome preparation”處理后的參考基因組[從UCSC（www.genome.ucsc.edu）上下載]上。此后，使用Bismark v0.23.1 軟件進行甲基化信息提取，并對唯一比對reads 比例值、平均測序深度進行測序質量評估。

1.7 年齡相關性分析與推斷年齡

將焦磷酸測序、NGS 技術所得DNA 甲基化水平代入年齡推斷公式[11]中計算個體的DNA 甲基化年齡并將其與個體真實年齡比較。

由1.5節、1.6節所得DNA甲基化水平，使用Graph-Pad Prism v8.4.3 軟件（美國GraphPad Software 公司，http：//www.graphpad-prism.cn）進行皮爾遜相關性分析，檢驗6個AR-CpG 在2種檢測技術下所測甲基化水平與樣本年齡之間的皮爾遜相關系數（Pearson correlation coefficient，r），使用配對t檢驗對同一位點2種檢測方法的結果進行差異性分析，檢驗水準α=0.05。

將DNA 甲基化水平代入年齡推斷模型[11]中計算DNA 甲基化年齡，參照文獻[11]對樣本年齡分組，計算不同年齡段以及不同性別模型中預測年齡的誤差。使用GraphPad Prism v8.4.3 軟件對推測的DNA 甲基化年齡與真實年齡的誤差進行比對，包括與年齡的r、R2、平均絕對誤差（median absolute deviation，MAD）、均方根誤差（root mean square error，RMSE）等，使用秩和檢驗對預測年齡和真實年齡進行誤差計算，以±5 歲的誤差評估推斷預測年齡的準確性。

2 結果

2.1 測序數據質量評估

6 個位點在3 次重復實驗中的變異系數在0.003 0（CpG4）～0.062 9（CpG2），提示焦磷酸測序技術的可重復性好。

對于NGS 測序數據，通過將NGS 測序數據與參考基因組比對，其唯一比對reads 比例在72.4%～83.1%。此外，6 個位點在不同樣本中的reads 數范圍為3 850～194 170條，其平均測序深度為8 414×（CpG4）～114 549×（CpG6）。

2.2 年齡相關性分析

對于每一個CpG 位點，得到焦磷酸測序和NGS 在不同樣本中的DNA甲基化水平與樣本年齡的r值，并與文獻[11]中相關參數進行對比。根據表3可以看出，CpG位點DNA 甲基化水平與年齡的r在不同檢測平臺存在一定差別。同時，將焦磷酸測序與NGS 在不同位點上的結果進行配對t檢驗，得到CpG1 的P值為0.000 8，CpG2～4 的P值均小于0.000 1，CpG5 的P值為0.000 1，只有CpG6的P值為0.101 1。

表3 CpG位點DNA甲基化水平與年齡的皮爾遜相關系數Tab.3 Pearson correlation coefficient between DNA methylation levels of CpG sites and chronological ages

2.3 推斷年齡的準確性

基于兩種平臺預測的DNA 甲基化年齡與真實年齡的r均高于0.90（圖1），其中焦磷酸測序技術的r為0.92，R2為0.85，MAD、RMSE 分別為4.81、6.26 歲；NGS技術的r為0.91，R2為0.84，MAD 和RMSE 分別為4.41、6.72 歲。焦磷酸測序和NGS 預測的年齡與個體真實年齡之間的配對秩和檢驗顯示，差異無統計學意義（P值分別為0.538 3 和0.809 3）。

圖1 樣本年齡與使用焦磷酸測序和NGS 檢測技術所得推斷年齡的散點圖Fig.1 The scatterplot of chronological ages and predicted ages detected by pyrosequencing and NGS

不同年齡段下的年齡推斷誤差結果如表4所示：幼兒和中青年人群（≤39歲）年齡推斷相對更準確；>60 歲人群中年齡推斷誤差增加，其中基于焦磷酸測序推斷誤差±5 歲的個體比例不足50.00%，在NGS 技術及文獻[11]中分別為54.00%和67.50%。

表4 不同年齡階段年齡推斷誤差比較Tab.4 Age prediction errors in different age groups （n=12）

性別分組結果（表5）顯示，基于男性年齡推斷模型在NGS技術下年齡推斷的MAD為3.50歲，對應焦磷酸測序技術下MAD為5.00歲，而基于SNaPshot技術的文獻[11]中的男性樣本組中MAD 為4.18 歲；基于女性年齡推斷模型在NGS技術下年齡推斷的MAD為5.31歲，對應焦磷酸測序技術下MAD 為4.74 歲，而基于SNaPshot技術的文獻中女性樣本組中MAD為4.30歲。

表5 不同性別年齡推斷模型下預測年齡的比較Tab.5 Comparison of predicted ages based on gender specific age prediction model

3 討論

本研究探討了依據SNaPshot 構建的針對中國漢族人群的年齡推斷模型[11]在焦磷酸測序和NGS 技術下用于中國華東漢族人群年齡預測的適用性。在PAN 等[11]的研究中，使用多重甲基化SNaPshot 技術針對中國漢族人群檢測了310 份年齡為2～86 歲的血液樣本，其模型包含6 個CpG 位點，其中與年齡相關性最高的是cg19283806（r為-0.870 4），相關性最低的是cg04208403（r為0.535 5）。使用支持向量回歸（support vector regression，SVR）和逐步回歸算法構建DNA 甲基化年齡推斷模型后，在驗證組其年齡推斷MAD 分別為4.56 歲和4.71 歲[11]。在本研究中，不論用焦磷酸測序還是NGS 技術，6 個CpG 位點均與年齡之間具有相關性。此外，基于PAN 等[11]逐步回歸算法構建的模型，使用焦磷酸測序和NGS 技術在中國華東漢族人群用于年齡推斷的MAD 分別為4.81 歲和4.41 歲。由此可以看出，通過重新設計引物實現了PAN 等[11]的研究中的DNA 甲基化年齡推斷模型在焦磷酸測序和NGS 技術中的有效轉化。

總體來看，基于PAN 等[11]的研究中的SNaPshot 技術以及本研究中的焦磷酸測序和NGS 技術估計的DNA 甲基化年齡與個體真實年齡的MAD 多小于5歲，在3 種技術下檢測到的CpG 位點與年齡的相關性以及預測年齡的誤差除了受不同年齡段和性別影響之外，還可能存在其他因素。首先，由于本研究與PAN等[11]的研究中用的樣本來源不一樣，樣本來源人群對AR-CpG 可能會存在一定的影響，如CpG1（chr17：44，390，358）在本研究中與年齡的相關性r為-0.705 7（焦磷酸測序）和-0.726 1（NGS），而在法國人群中只有0.464[18]；CpG6（cg19283806）在本研究中與年齡的相關性r為-0.848 4（焦磷酸測序）和-0.839 4（NGS），而在韓國人群的研究中為-0.906 1[19]，在法國人群中為-0.672[18]。因此，本研究觀察到的CpG 位點與年齡的相關性與PAN 等[11]研究中的不一致可能與樣本來源不一樣有關，這是由于DNA 甲基化水平會受環境、個體差異的影響[20-21]。其次，PAN 等[11]的研究證實了性別對DNA 甲基化年齡推斷的影響。性別因素也可能是影響三組數據的原因之一。至于基于不同性別開發的DNA 甲基化年齡推斷是否能更精準地推斷年齡還值得進一步探討。

此外，本研究發現CpG 位點的甲基化水平還可能受到檢測平臺的影響。為驗證這一點，本研究對比了焦磷酸測序和NGS 技術兩種測序技術的結果，在對同一位點的DNA 甲基化水平的測定結果分析后，在6 個CpG 位點中，除了CpG6（P=0.101 1）外，其余5 個DNA甲基化水平在兩種檢測技術中表現出的差異均具有統計學意義（配對t檢驗），但從對單個位點的差異趨勢來看，并未得到NGS 技術或焦磷酸測序技術檢測的DNA 甲基化水平明顯更高或更低的結論。代入模型后，對預測年齡的配對秩和檢驗結果提示，兩種檢測方法均可用于甲基化年齡預測，但同時應注意兩種技術檢測的甲基化水平存在一定差異。對于NGS 技術而言，盡管本研究中不同CpG 位點在樣本中的測序深度均在3 000×之上，不同位點在不同樣本中的測序深度并非完全一致，這可能與多樣本混樣不均有關。

值得注意的是，本研究發現，>60 歲人群的甲基化水平與整體變化趨勢的離散更明顯，焦磷酸測序在該年齡組的MAD 值為6.67 歲，使用NGS 技術在該年齡組的MAD 為4.66 歲。同時按照原文獻中對預測年齡的評估方法，以5 歲的誤差對各年齡段的預測效果進行對比，盡管基于NGS 技術有67.00% >60 歲個體其預測年齡與真實年齡的差異在5 歲以內，但高于其他組的誤差（2.80～3.74 歲），提示年齡推斷模型在高齡樣本中用于年齡推斷有一定局限性。

受本研究樣本量較小及樣本來源、年齡分布與原始研究不同的影響，雖存在一定的偶然因素，與原模型的對比未必準確。從法醫學實踐的角度來看，在保證模型預測準確性的前提下，焦磷酸測序操作和分析時間短，更適用于小樣本實驗。目前，對于AR-CpG的篩選仍多依靠高通量測序，本研究雖樣本量有限，但仍能為基于DNA 甲基化的年齡推斷模型的應用提供一定依據。