長鏈非編碼RNA LINC00958在頭頸部鱗狀細胞癌的表達和初步研究

吉 幻,李 萌,姚恩惠,鐘 旖,張雨垚,武和明,李 斌

頭頸部鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤,每年發生超過60萬例,其5年生存率僅有50%～60%。主要由于大多數患者確診時已經是中晚期,淋巴結轉移率高[1-2]。因此,尋找與HNSCC發生、發展相關的因子,對HNSCC的早期診斷、早期干預以及早期治療極為重要。

近年來研究發現HNSCC的發生發展與長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs,LncRNA)密切相關[3]。LncRNA是近年來發現的一類長度超過200 bp的RNA,其主要功能是通過調控基因或競爭性靶向miRNA調控腫瘤的生物學過程,可間接或直接發揮抑癌或促癌作用,抑制或加速腫瘤的發生發展[4]。LINC00958在肝癌、肺癌、口腔癌等多種腫瘤中表達上升并調節腫瘤發生發展,然而目前LINC00958在HNSCC中的表達及其對增殖和遷移的影響鮮見報道[5-7]。

本研究旨在探索LINC00958在HNSCC中表達及其與腫瘤預后的相關性,以及其對HNSCC細胞增殖和轉移的影響,并驗證LINC00958是否可通過調控miR-877-3p影響HNSCC的增殖和轉移能力,從而為HNSCC的診斷和臨床治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數據庫、組織樣本及相關細胞系 基于基因表達水平值的交互式分析平臺(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA),簡稱GEPIA數據庫,可利用癌癥基因譜圖譜庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA)的RNA表達譜數據,行差異基因分析、生存曲線分析,或根據病理及癌癥分型分析等。收集15對2021年1月至2021年12月于南京醫科大學附屬口腔醫院就診的HNSCC患者的癌及癌旁正常組織樣本。患者均知情同意,本研究經南京醫科大學醫學倫理委員會批準(PJ2020-116-001)。CAL27、HN4和HN6細胞系為HNSCC細胞系,HOK為人正常口腔黏膜上皮細胞系,均購買于上海細胞系庫。

1.1.2 實驗試劑及儀器 CCK-8試劑盒(APExBIO,美國);PCR引物(銳博,中國廣州);PCR試劑盒、反轉錄試劑盒(Takara,日本);小干擾RNA(吉瑪,中國上海);miR-877-3p mimics(吉瑪,中國上海);Dual-Glo Luciferase Reporter Assay(Promega,美國);miRNA PCR引物(銳博,中國廣州);GAPDH抗體(Proteintech,中國武漢);E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、Vimentin抗體(Cell Signaling Technology,美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染 CAL27和HOK使用DMEM高糖培養,HN4和HN6使用DMEM/F12培養。細胞培養箱條件為37 ℃、5% CO2濃度。根據LipofectamineTM2000說明書進行轉染。每孔5 μL脂質體,與250 μL培養基輕輕混勻,靜置5 min;分別取100 pmol的si-LINC00958、si-NC、miR-877-3p mimic或mimics NC稀釋于250 μL OPTI-MEMI中,將兩種溶液輕吹混合,靜置20 min,轉染至六孔板內細胞中,輕振混勻,轉染6～8 h后,換成含血清的培養液,按要求培養細胞。

1.2.2 組織總RNA提取 使用微量勻漿器充分研磨癌組織樣本及相應癌旁正常組織樣本。加入適量預冷Trizol,混勻,孵育10 min,然后4 ℃,12 000 r/min離心10 min,除去不溶解物質。加入適量氯仿溶液,振蕩器15～30 s混勻,室溫孵育5 min。4 ℃,12 000 r/min離心10 min。上層水相移入無RNA酶的EP管,加入等量異丙醇,混勻,常溫放置20 min。4 ℃,12 000 r/min,離心10 min。留沉淀,預冷75%乙醇,加入約1 mL乙醇,混勻。4 ℃,7 500 r/min離心5 min。棄上清液,沉淀內加入預冷的DEPC水,混勻。定量RNA濃度和純度。

1.2.3 細胞總RNA提取 收集細胞沉淀,沉淀內加入適量Trizol,吹打細胞,孵育10 min。余步驟同1.2.2步驟提取。

1.2.4 實時定量PCR反應 取1.2.2和1.2.3步驟獲取的RNA,用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA,用PCR試劑盒進行實時定量PCR,LINC00958和miR-877-3p分別以GAPDH和U6作為內參基因,用2-ΔΔCt對目的基因表達進行定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 CCK-8檢測細胞增殖 轉染細胞,培養至對數生長期,收集細胞。1 mL培養液重懸細胞,計數,接種于96孔板中,每孔3×103個細胞。于0、24、48、72、96、120 h分別檢測。用培養基配制10% CCK-8混合液,每孔100 μL。37 ℃避光孵育2 h,在450 nm處測定吸光度。

1.2.6 Transwell實驗 包括細胞遷移實驗和細胞侵襲實驗。細胞遷移實驗:取24孔板,放入小室,小室下方加600 μL含10% FBS的培養液,小室內加入200 μL細胞懸液,將細胞在37 ℃下培養24 h,固定細胞,結晶紫染色, 清洗小室, 自然晾干。 細胞侵襲實驗:預先用無血清的培養液按1∶8稀釋Matrigel膠,取60 μL稀釋膠加到上室中,37 ℃孵育至少30 min,其余步驟同細胞遷移實驗。正置顯微鏡選擇適當放大倍數拍照,用ImageJ軟件分析。

1.2.7 生物信息學分析 采用以下2個數據庫預測LINC00958下游miRNA:DIANA TOOLS(http://diana.imis.athena-innovation.gr)和RegRNA 2.0(http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw)。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因實驗 預測LINC00958和miR-877-3p的結合位點。構建包含LINC00958的野生型(WT)序列和突變(MUT)序列,分別插入GP-miRGLO載體,由上海吉瑪公司合成,命名為GP-miRGLO-LINC00958-WT和GP-miRGLO-LINC00958-MUT。取對數生長期并狀態良好的CAL27和HN6細胞,接種到24孔板中。按照LipofectamineTM2000試劑說明轉染,將2 μg GP-miRGLO-LINC00958-WT或GP-miRGLO-LINC00958-MUT,50 nmol miR-877-3p mimics或mimics NC,與2 μL脂質體混合,室溫孵育20 min。共轉染48 h后,使用Promega公司的Dual-Glo Luciferase Reporter Assay試劑盒檢測。

1.2.9 免疫蛋白質印跡(Western Blot) 提取總蛋白,用BCA試劑盒測定蛋白濃度,蛋白進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉至PVDF上,用5%脫脂奶粉室溫封閉后分別加入一抗4 ℃過夜,洗膜后加入二抗,室溫孵育1 h,用ECL化學發光液顯色。

1.2.10 細胞核質分離實驗 采用Paris Kit試劑盒。收集所需細胞,向細胞沉淀中加入細胞分離液,吹打重懸細胞,放置冰上裂解,離心。離心后上清液即是細胞質,沉淀為細胞核。取上清液至新的EP管,向沉淀加細胞裂解液,渦旋混勻。管內加入適量的2×lysis/Binding Buffer用于裂解細胞核與細胞質中,將無水乙醇分別加入細胞核與細胞質,混勻。標記吸附管,將混合液移入相應的管內,加入Wash Solution 1,離心,加入洗滌液,離心。向吸附管內加入預熱的洗脫液,離心。定量檢測RNA濃度,置-80 ℃保存。用于后續細胞核質RNA檢測實驗。

1.3 統計學分析

本研究實驗數據均采用均數±標準差顯示,采用SPSS 22.0分析數據,實驗均獨立重復3次。兩組間比較采用t檢驗分析,多組比較采用one-way ANOVA單因素方差分析,多組間兩兩比較采用Dunnett檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 TCGA數據庫中LIN00958在HNSCC組織中的表達和臨床意義

分析GEPIA數據庫中519例HNSCC組織和44例癌旁正常組織中LINC00958表達發現,與癌旁正常組織相比,LINC00958在HNSCC組織中的表達明顯升高(圖1A),生存曲線分析發現HNSCC患者組織中LINC00958表達越高,其預后越差(圖1B)。

A:組織中LINC00958表達;B:生存曲線分析;*:P<0.05

2.2 LIN00958在HNSCC組織和細胞中的表達

實時定量PCR實驗結果顯示,相較于癌旁正常組織,LINC00958在HNSCC組織中的表達明顯升高(圖2A)。在HNSCC細胞系CAL27、HN4和HN6中,LINC00958的表達水平明顯高于人正常口腔黏膜細胞系HOK(圖2B)。此外,通過檢測CAL27和HN6細胞核和細胞質中RNA發現,LINC00958主要表達在細胞質中(圖2C、D)。

A:組織中LINC00958表達;B:細胞中LINC00958表達;C、D:LINC00958在CAL27和HN6細胞中分布;**:P<0.01;***:P<0.001

2.3 LINC00958對CAL27和HN6細胞增殖能力的影響

結果顯示,將si-LINC00958轉染到CAL27和HN6細胞后,CAL27和HN6細胞中LINC00958表達明顯降低(圖3A)。CCK-8實驗檢測LINC00958對HNSCC細胞系CAL27、HN6生長的影響。結果表明,與轉染si-NC組相比,轉染si-LINC00958組的CAL27和HN6細胞吸光度值明顯降低(圖3B、C)。

A:si-LINC00958轉染效率驗證;B:CAL27細胞增殖曲線;C:HN6細胞增殖曲線;**:P<0.01;***:P<0.001

2.4 LINC00958對CAL27和HN6細胞遷移和侵襲能力的影響

細胞遷移和侵襲實驗結果顯示,與轉染si-NC組相比,轉染si-LINC00958組的CAL27和HN6細胞在顯微鏡下穿過小室的細胞數量減少,表現出較弱的遷移和侵襲能力(圖4A、B)。

2.5 LINC00958對EMT通路相關蛋白的影響

Western Blot曝光實驗結果表明,敲低LINC00958后,N-cadherin、Vimentin(間充質標志物)蛋白表達水平下降,E-cadherin(上皮標志物)蛋白表達增高(圖5A、B)。

A:CAL27細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達情況;B:HN6細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達情況

2.6 miR-877-3p在HNSCC組織和細胞中的表達

實時定量PCR實驗結果顯示,相較于癌旁正常組織,miR-877-3p在HNSCC組織中的表達含量明顯降低(圖6A)。在HNSCC細胞系CAL27、HN4和HN6中,miR-877-3p的表達水平明顯低于人正常口腔黏膜細胞系HOK(圖6B)。

A:miR-877-3p在組織中表達;B:miR-877-3p在細胞中表達;**:P<0.01;***:P<0.001

2.7 LINC00958負向調節miR-877-3p表達

PCR結果顯示,敲低LINC00958后miR-877-3p在CAL27和HN6表達量增高,并有顯著意義(圖7A)。通過預測miR-877-3p與LINC00958的結合位點,構建LINC00958野生型(GP-miRGLO-LINC00958-WT)質粒和LINC00958突變型(GP-miRGLO-LINC00958-MUT)質粒(圖7B)。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示:只有在CAL27和HN6細胞中共轉染LINC00958野生型質粒(GP-miRGLO-LINC00958-WT)和miR-877-3p mimics,熒光素酶活性才顯著降低(圖7C)。

′A:轉染si-LINC00958后細胞中miR-877-3p的表達;B:LINC00958和miR-877-3p結合位點;C:CAL27和HN6細胞系熒光素酶活性;*:P<0.05;**:P<0.01;ns:無統計學意義

2.8 miR-877-3p對CAL27和HN6細胞增殖能力的影響

PCR結果顯示,將miR-877-3p mimics轉染到CAL27和HN6細胞系中后,細胞系中miR-877-3p表達明顯升高(圖8A)。CCK-8實驗結果表明,與轉染NC組相比,轉染miR-877-3p mimics組的CAL27和HN6細胞450 nm吸光度值明顯降低(圖8B、C)。

A:miR-877-3p mimics轉染效率驗證;B:CAL27細胞增殖曲線;C:HN6細胞增殖曲線;*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001

2.9 miR-877-3p對CAL27和HN6細胞遷移和侵襲能力的影響

細胞遷移和侵襲實驗結果顯示,與轉染NC組相比,轉染miR-877-3p mimics組的CAL27和HN6細胞在顯微鏡下穿過小室的細胞數量減少,表現出較弱的遷移和侵襲能力(圖9A、B)。

A:鏡下遷移實驗結晶紫染色后小室圖和統計分析;B:鏡下侵襲實驗結晶紫染色后小室圖和統計分析;比例尺=100 μm;**:P<0.01;***:P<0.001

2.10 miR-877-3p對EMT通路相關蛋白的影響

Western Blot曝光實驗結果表明,轉染miR-877-3p mimics后,N-cadherin、Vimentin(間充質標志物)蛋白表達水平下降,E-cadherin(上皮標志物)蛋白表達增高(圖10)。

A:CAL27細胞中miR-877-3p對EMT相關蛋白的影響;B:HN6細胞中miR-877-3p對EMT相關蛋白的影響

3 討 論

LncRNA屬于一類新發現的RNA,其轉錄本包含200多個不編碼蛋白質的核苷酸[8]。近年來研究表明LncRNA的失聯在多種癌癥的發生和發展中起著至關重要的作用。LncRNA可作為致癌因子,通過與其他RNA的交叉作用和多種基于染色質的機制促進多種癌癥的生長或轉移。LncRNA可通過調節蛋白質編碼能力、在轉錄水平及轉錄后水平改變基因表達進而調控惡性腫瘤發生發展過程,影響腫瘤生長、轉移等,有望成為治療惡性腫瘤的靶向分子[4,9]。

研究表明,LINC00958在多種惡性腫瘤中高表達并與腫瘤發生發展有關[10]。據報道,在肺腺癌中,LINC00958作為miR-625-5p海綿,促進細胞增殖、遷移或侵襲能力[6]。LINC00958可通過miR-627-5p促進口腔鱗狀細胞癌細胞增殖和遷移[7]。本研究發現,與相鄰的正常組織相比,LINC00958在15個HNSCC腫瘤組織中表達量明顯上調。后續的研究結果證實,沉默LINC00958可以顯著抑制HNSCC的細胞增殖、遷移和侵襲。通過分析GEPIA數據庫,結果發現HNSCC患者的LINC00958表達升高提示患者預后不佳。本研究進一步驗證了LINC00958在HNSCC進展中的重要作用。

上皮間充質轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT)和腫瘤發生發展、腫瘤轉移等密切相關,其顯著標志是上皮標志物(如E-cadherin)的下降和間充質標志物(如N-cadherin、Vimentin)的上升[11-12]。此外,EMT通常和很多轉錄因子有關,如snail、slug、ZEB1和TWIST等,這些轉錄因子能通過不同途徑抑制E-cadherin表達,影響EMT[13-14]。據報道,LncRNA在調節EMT進程中具有重要作用,有望成為抑制EMT和腫瘤轉移的關鍵分子[15-16]。為了探索LINC00958促進HNSCC發生發展的機制。本研究通過WB實驗發現,與NC組相比,轉染si-LINC00958后,E-cadherin蛋白表達量顯著上升,而N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平明顯下降,提示LINC00958通過調控EMT影響HNSCC細胞的增殖和轉移。

近年來,研究表明LncRNA可以通過競爭與microRNA結合而發揮競爭內源性RNA(competing endogenous RNAs,ceRNAs)的作用[17]。MicroRNA是22 nt左右的小RNA分子,可以通過與靶mRNA結合來沉默基因和抑制翻譯。MicroRNA在心血管疾病、視網膜疾病、癌癥等多種人類疾病的發生和發展中發揮著重要作用[18-19]。此前已有多種研究表明,LINC00958可通過作用miRNA調節癌癥進展。如LINC00958通過浸潤miR-625-5p,上調LRRC8E表達,促進宮頸癌細胞增殖和轉移[20]。LINC00958通過作用miR-627-5p,調節YBX2表達,促進口腔鱗狀細胞癌細胞增殖和遷移[7]。

通過生物信息學研究,我們預測miR-877-3p可能與LINC00958結合。通過qRT-PCR實驗證實,與NC組相比,沉默LINC00958后miR-877-3p在CAL27和HN6細胞中的表達明顯上調。因此我們推測LINC00958可能負向調節miR-877-3p。通過功能實驗,我們證實在HNSCC中miR-877-3p是腫瘤抑制因子,抑制HNSCC細胞增殖和轉移能力,其對細胞增殖和轉移的作用與LINC00958相反。接下來本研究通過雙重熒光素酶報告基因,驗證了LINC00958與miR-877-3p存在直接結合。根據這些研究結果,我們認為LINC00958可結合miR-877-3p,在HNSCC發揮致癌基因作用。此外,本研究發現,與NC組相比,過表達miR-877-3p后,E-cadherin(上皮標志物)表達量顯著上升,而間充質標志物(N-cadherin和Vimentin)蛋白表達水平明顯下降,提示過表達miR-877-3p抑制HNSCC細胞的EMT通路。

綜上所述,本研究發現LINC00958在HNSCC中高度上調,LINC00958可結合并負向調節miR-877-3p,通過調控EMT促進HNSCC的增殖、遷移和侵襲能力;LINC00958可能是HNSCC的新型治療生物標志物。然而,在HNSCC中,LINC00958如何通過海綿作用吸附miR-877-3p來調控下游信號通路的機制有待進一步深入研究。