miR-191-5p通過靶向TJP1調控Cal-27細胞增殖、侵襲和遷移的體外研究

佟雪溪,趙 剛,2

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是頭頸部癌癥患者最常見的殺手之一,盡管在診斷和治療方面取得一定進展,但復發(fā)率和死亡率仍然很高,尋找新的生物標志物對早期發(fā)現、病中監(jiān)測以及疾病預后預測具有重要意義。研究數據顯示下調的miR-191-5p通過靶向TJP1來抑制OSCC。

miRNA是長度為18～25個核苷酸的短鏈非編碼RNA,其與基本上所有已知的病理和生理過程(包括癌癥)相關聯(lián)。miRNA對癌癥相關機制影響的研究集中在細胞增殖、對細胞死亡的抗性、上皮間質轉化過程誘導的轉移和血管生成[1]。循環(huán)miRNA可作為癌癥生物標志物,miRNA組合可用于癌癥風險預測,已經有研究者進行了幾項涉及miRNA檢測的早期臨床試驗[2]。有研究證實miRNA在血清中可以相當穩(wěn)定并且易于通過各種測定法被檢測[3],這說明了miRNA作為早期癌癥生物標志物的可能性。

miR-191是miR-191/425簇的一部分,該簇是高等真核生物的重要參與者,位于人類3號染色體(3p21.31)上 DALRD3 基因的第一個內含子,編碼四種成熟miRNA:miR-191-5p、miR-191-5p-3p、miR-425-5p和 miR-425-3p。有研究表明miR-191-5p在細胞分化和發(fā)育中起重要作用,包括加速促進衰老[4]、促進紅細胞生成[5]以及成骨方面[6]發(fā)揮了重要介質作用。miR-191是一種高度保守的miRNA,它被發(fā)現在20 多種不同的癌癥中異常表達,并被證明是其中一些癌癥的主要參與者。最近的研究發(fā)現口腔鱗癌患者外周血中miR-191高度表達,認為其是具有較高早期診斷潛力的生物標志物[7]。本研究通過開展體外實驗探究miR-191-5p對OSCC細胞的影響及其機制,為OSCC的靶向治療提供新的治療靶點和治療策略。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

Trizol、Lipo3000試劑購自美國Invitrogen,miR-191-5p inhibitor、inhibitor NC和si-TJP1、si-NC購自淼靈質粒平臺,逆轉錄試劑盒HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR和ChamQ Universal SYBR試劑盒購自南京Vazyme公司,CCK-8試劑盒購自博士德公司,TJP1、GAPDH 抗體購自武漢ABclonal公司,E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體購自上海Abways公司,雙熒光素酶檢測試劑盒購自上海碧云天公司,miRNA第一鏈cDNA合成(加尾法)試劑盒和miRNA熒光定量PCR試劑盒(染料法)購自上海生工。

1.2 生物信息學分析

從StarBase數據庫( http://starbase．sysu．edu．cn)中的 Pan-Cancer 模塊中分析miR-191-5p得到miR-191-5p在多種癌癥中的差異表達數據。接著使用公開數據庫TargetScan、miRBase和miRanda分析miR-191-5p的候選靶基因并取交集。得到的候選靶基因分別在StarBase數據庫Gene Differential Expression模塊中分析在人頭頸部鱗癌中的表達差異,并在RNA-RNA CoExpression模塊進行miR-191-5p與候選靶基因的相關性分析。

1.3 細胞轉染與分組

人口腔鱗癌細胞Cal-27購自武漢普諾賽生命科技有限公司。將細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(BI,以色列),1%青-鏈霉素(博士德,中國)的完全DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco,美國)中,37 ℃和5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按照lipo 3000轉染步驟,對Cal-27細胞轉染miR-191-5p inhibitor、inhibitor NC,空白組為空轉染的Cal-27細胞。為驗證TJP1的作用,設計細胞分組為對照組(轉染miR-191-5p inhibitor+si-NC)和實驗組(轉染miR-191-5p inhibitor+si-TJP1)。

1.4 qRT-PCR檢測

采用Trizol法提取細胞總RNA,使用超微分光光度計(Colibri)測量RNA濃度和純度,按照逆轉錄試劑盒說明書獲得cDNA反應液。按照SYBR試劑盒說明對miR-191-5p和TJP1 mRNA的表達水平進行檢測。分別以U6和GAPDH作為內參,實驗設置6個重復。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 CCK-8增殖檢測

將轉染處理后對數生長期細胞,接種于96孔板中1 000個/孔,分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后每孔加入CCK-8試劑(1∶9),置培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)1 h,用酶標儀測定波長490 nm處吸光度值(optical density,OD)。

1.6 細胞克隆形成實驗

將每組轉染后的細胞確認轉染效率合適后,用0.25%胰蛋白酶分離并分散成單細胞,將每組細胞懸液細胞計數后以1×103個/孔的密度接種于6孔板中,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當培養(yǎng)皿中單個克隆細胞團鏡下數量大于等于50個時可停止培養(yǎng),0.1%結晶紫溶液染色,用倒置顯微鏡拍照并統(tǒng)計集落數量。

1.7 Transwell實驗檢測

Matrigel膠包被Transwell小室上室,將2×104個細胞接種到含無血清培養(yǎng)基的上室中,在小室下室中加入600 μL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。37 ℃,5% CO2培養(yǎng)24 h,用PBS清洗小室3次,用4%多聚甲醛固定小室30 min,擦去Matrigel膠及未侵襲的細胞,0.1%結晶紫染色。用PBS洗凈,干燥后正置顯微鏡觀察,隨機觀察6～10個視野,記錄每個視野內陽性細胞數并進行統(tǒng)計分析。

1.8 劃痕實驗檢測

將細胞接種到六孔板中,分別進行轉染處理。用200 μL無菌槍頭垂直于橫線劃痕。用PBS洗滌去除懸浮細胞和細胞碎片。添加新鮮的無血清培養(yǎng)基,倒置熒光顯微鏡拍照記錄0 h細胞愈合圖像,培養(yǎng)板放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),每隔12 h取出6孔板拍照記錄細胞的傷口愈合情況至傷口完全愈合;收集圖片數據,Image J軟件分析細胞傷口愈合率。

1.9 雙熒光素酶報告基因實驗

通過生信網站預測miR-191-5p與TJP1的結合位點,將miR-191-5p與TJP1結合部位的序列及其突變體序列插入到螢火蟲熒光素酶基因下游構建表達載體(Promega,美國)。將miR-191-5p mimics與pmirGLO-TJP1-WT/MUT重組質粒,以及對照組mimics NC與TJP1的野生型或突變型重組質粒,利用Lipo3000轉染至293T細胞。轉染48 h后,根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.10 Western blotting檢測

使用細胞裂解液提取細胞總蛋白,用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取20 μg蛋白加1×上樣緩沖液煮沸變性,通過SDS-PAGE將蛋白分離并轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h后,加入一抗,4 ℃過夜孵育。次日洗膜3次,加入二抗,在溫室中孵育1 h。再洗膜3次后,加入發(fā)光試劑使蛋白顯影,置于凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像。以GAPDH為內參,Image J軟件計算蛋白相對表達量。

1.11 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 8軟件用于數據處理分析與圖形繪制。實驗重復三次,數據表示為平均值±標準偏差。兩組之間的比較使用t檢驗分析,多組比較使用單因素或雙因素方差分析。P<0.05表示差異顯著并具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 miR-191-5p在OSCC中高表達

中山大學StarBase數據庫分析顯示,相比于正常組織miR-191-5p在癌組織中表達量高(圖1),而OSCC是最常見的頭頸部癌癥類型,因此我們有理由懷疑miR-191-5p可能在OSCC進展中起重要作用。

圖1 miR-191-5p在口腔鱗癌組織中表達上調

在TJP1的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)中發(fā)現了miR-191-5p的互補區(qū)。在先前的研究中,miR-191-5p已被驗證為在肝細胞癌中通過抑制TJP1的信號傳導增加HCC細胞侵襲性[8]。進一步研究miR-191-5p在OSCC中的潛在機制,StarBase數據庫分析結果發(fā)現與非癌組織相比人OSCC組織中TJP1表達水平下調(圖2)。為進一步探討miR-191-5p與TJP1在口腔鱗狀細胞癌中的關系,對兩者的共表達相關性分析顯示TJP1的表達與miR-191-5p呈負相關,P<0.05有統(tǒng)計學差異(圖3)。

圖2 TJP1在口腔鱗癌組織中表達下調

圖3 TJP1與miR-191-5p表達呈負相關

2.2 下調miR-191-5p可抑制口腔鱗癌細胞增殖

與inhibitor NC組比較,miR-191-5p inhibitor組細胞中miR-191-5p的表達顯著降低(圖4A)。CCK-8實驗結果顯示空白組和inhibitor NC組在24 h后細胞增殖能力明顯提升,而miR-191-5p低表達后Cal-27細胞的增殖能力較inhibitor NC組顯著降低(圖4B)。克隆實驗結果顯示,與對照組相比miR-191-5p inhibitor組細胞集落數量少,說明細胞集落形成能力顯著降低(圖4C)。

A:qRT-PCR檢測轉染效率;B:CCK-8法檢測細胞增殖;C:克隆實驗0.1%結晶紫染色圖;****:P<0.000 1

2.3 下調miR-191-5p抑制口腔鱗癌細胞的轉移和上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)

Transwell實驗和劃痕實驗結果顯示,與inhibitor NC組比較,miR-191-5p inhibitor組Cal-27細胞的侵襲細胞數目減少、相對遷移率變小(圖5),這說明了抑制miR-191-5p減弱了Cal-27細胞的侵襲遷移能力。EMT在癌細胞惡性轉化中起到關鍵作用,Western blotting結果顯示敲低miR-191-5p后,Cal-27細胞中E-cadherin的表達顯著升高,N-cadherin和Vimentin的蛋白表達水顯著降低(圖6)。表明降低miR-191-5p參與抑制OSCC細胞的轉移和EMT形成。

A:Transwell測定法測定細胞侵襲;B:劃痕愈合測定法測定細胞遷移。**:P<0.01

A:蛋白條帶表達;B:蛋白表達量化比較;**:P<0.01

2.4 miR-191-5p靶向TJP1

通過生信數據庫預測結果可知,miR-191-5p與TJP1間存在互作序列(圖7)。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示,miR-191-5p過表達組的熒光素酶活性顯著低于mimics NC組。然而,TJP1的3′-UTR區(qū)突變組的熒光素酶活性表現出不同的結果,證實miR-191-5p可以靶向結合TJP1(圖8)。Western blotting檢測結果顯示,TJP1蛋白表達在過表達miR-191-5p的細胞中顯著降低,而抑制miR-191-5p可上調TJP1表達(圖9A),qRT-PCR結果也顯示過表達miR-191-5p后細胞中TJP1的表達降低(圖9B);上述結果表明TJP1是miR-191-5p的靶向基因。

圖7 miR-191-5p與TJP1的靶向結合位點

****:P<0.000 1

A:WB檢測TJP1的表達;B:qRT-PCR檢測過表達miR-191-5p后TJP1的表達;**:P<0.01 vs. mimics NC/inhibitor NC;****:P<0.000 1 vs. mimics NC

2.5 miR-191-5p通過靶向TJP1促進OSCC的進展

qRT-PCR結果顯示 miR-191-5p低表達的細胞中轉染siRNA-TJP1 成功下調了 TJP1 的表達(圖10A),實驗進一步檢測對比miR-191-5p inhibitor+si-NC組,同時下調TJP1后Cal-27細胞的增殖能力增強、侵襲細胞數增多、細胞遷移率明顯增強,表明下調TJP1可以在一定程度上逆轉miR-191-5p對Cal-27細胞增殖和遷移侵襲的抑制(圖10B～D),這些結果表明miR-191-5p操控并抑制TJP1從而促進OSCC細胞的增殖、遷移和侵襲。

A:qRT-PCR驗證轉染效率;B: CCK-8法檢測細胞增殖;C:Transwell實驗檢測細胞侵襲能力;D:劃痕實驗檢測細胞遷移能力;****:P<0.000 1; **:P<0.01

3 討 論

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是最常見的侵襲性癌癥之一。雖然目前手術切除、化學療法和放療能夠被用于治療OSCC患者,但由于OSCC具有較強的侵襲和轉移性質,患者在術后往往會出現復發(fā)、腫瘤轉移或生存差的情況[9],迫切需要揭示OSCC發(fā)生發(fā)展的分子機制以開發(fā)新穎有效的OSCC治療策略。本研究數據顯示下調的 miR-191-5p 通過靶向TJP1來抑制OSCC。

miRs失調與口腔癌的癌變和進展有關,通過與mRNA 3′-UTR結合導致mRNA降解或翻譯受阻,在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮復雜多樣的功能[10]。以口腔鱗癌OSCC為例,新型LINC00472通過miR-455-3p/ELF3軸抑制口腔鱗狀細胞癌生長[11];miR-340-5p靶向內質網應激蛋白PERK和ATF6,以影響口腔鱗狀細胞癌增殖和侵襲[12]。miR-191-5p的功能因腫瘤而異,到目前為止,許多證據表明miR-191-5p在腫瘤發(fā)生及乳腺癌[13]、結腸癌[14]等多種癌癥中的失調中起重要作用。然而在一些癌癥中miR-191-5p呈下調表達,如在腎細胞癌細胞系中的下調[15]與本研究結果相矛盾。但目前在OSCC中的作用及相關機制尚不清楚。通過本研究發(fā)現miR-191-5p在OSCC組織及細胞中表達顯著升高,體外實驗顯示敲低miR-191-5p能夠抑制OSCC細胞增殖、侵襲和遷移能力。

EMT是一種常伴隨腫瘤轉移和侵襲的生物學活動[16],目前認為,EMT發(fā)生的主要標志是E-cadherin表達降低、N-cadherin和Vimentin的表達升高,引起腫瘤細胞間的黏附能力下降,運動能力增加,腫瘤細胞更易發(fā)生浸潤或轉移。Transwell和劃痕愈合測定以及蛋白質印跡分析的結果表明,隨著E-cadherin表達的改善,下調的miR-191-5p抑制 OSCC增殖、侵襲遷移和EMT,并降低N-cadherin和Vimentin水平。有研究顯示在肺癌細胞中,miR-191-5p 促進細胞侵襲遷移以及EMT并具有癌癥干細胞樣特性[17]。研究結果顯示體外下調miR-191-5p抑制了口腔鱗癌細胞生長和EMT,下調的miR-191-5p可能有助于阻斷OSCC進展。

為進一步揭示miR-191-5p的潛在作用機制,生物信息學分析發(fā)現TJP1是其潛在的靶基因,并通過雙熒光素酶報告基因測定進行了驗證。TJP1(也稱ZO-1)是膜相關鳥苷酸激酶同系物家族的成員,通過上皮表型相關基因和上調間質細胞表型相關基因來調控EMT相關基因的轉錄,參與促進細胞分化和遷移并與癌癥干細胞表型相關[18]。細胞-細胞連接蛋白在維持組織結構中起著至關重要的作用,但在不同的癌癥中通常會失調。越來越多的研究表明TJP1表達下調與癌癥擴散和轉移增強相關[19],例如TJP1可以促進胃癌細胞的增殖和運動[20]。最近的研究表明TJP1定位于突出的板狀偽足和細胞后部細胞接觸位點的基部[21],表明TJP1可能對牽引力和拉力之間的相互作用很重要。通過與TJP1蛋白相互作用動態(tài)調控E-cadherin表達和定位是闡明癌癥轉移集體遷移機制的關鍵因素,這也與本研究結果一致。數據庫分析結果顯示TJP1在OSCC中下調,miR-191-5p的下調增加了TJP1蛋白的表達水平,抑制了口腔鱗癌細胞的侵襲性。本實驗為了驗證TJP1的作用,將siRNA-TJP1轉染到miR-191-5p低表達的細胞中,同時下調TJP1后Cal-27細胞的增殖和侵襲遷移顯著增強,表明下調TJP1可以逆轉敲低miR-191-5p對Cal-27細胞增殖和遷移的抑制作用。

綜上所述,miR-191-5p在口腔鱗狀細胞癌中高表達,體外下調miR-191-5p可顯著抑制OSCC細胞增殖侵襲遷移和EMT形成,miR-191-5p可通過靶向緊密結合蛋白TJP1發(fā)揮這一功能。由于實驗條件有限僅使用一種OSCC細胞開展研究,本研究需要進一步探索miR-191-5p對其他口腔鱗癌細胞的影響以及其他靶標的潛在機制。盡管這只是一項臨床前研究,我們的研究結果為口腔鱗狀細胞癌治療提供了一些線索,但實驗結果和在臨床實踐中的有效應用需要進一步驗證。未來需要深入探究miR-191-5p對口腔鱗狀細胞癌的臨床影響,以證實當前發(fā)現在臨床實踐中的臨床相關性。