基于多重實時熒光定量PCR技術檢測高危型人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA的臨床研究

劉娜 李倩 魯潔

(延安大學附屬醫院檢驗科,陜西 延安 716000)

有研究認為,高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染通常和宮頸癌的發生發展存在密切關系,絕大多數宮頸癌患者是由高危HPV的持續感染引起,故此,高危HPV持續感染成為宮頸癌發生及發展的必要條件。但部分女性感染的HPV存在一過性,其中長時間持續感染率僅10%左右[1]。既往臨床認為HPV DNA檢查存在一定應用價值,但實際使用中發現其特異度較低,在臨床診斷中局限性較大,甚至增加誤診漏診風險[2]。此外,高危HPV一旦感染宿主后,其自身病毒基因組通常整合至宿主基因組內,若HPV本身的核酸整合進入宿主基因組,其轉錄水平隨之提升,說明宮頸組織出現異常,并逐漸惡化[3]。而HPV E6/E7 mRNA在病毒的活動程度和疾病的進程中具有一定監測作用,可達到早發現、早治療的目的,并為宮頸癌篩查提供參考[4]。因此,本文研究基于多重實時熒光定量PCR技術檢測高危型人乳頭瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA的價值。現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2022年1月至2022年7月我院進行宮頸癌篩查的患者60例,年齡25～61歲,平均年齡(43.09±2.54)歲;體質指數17～23 kg/m2,平均體質指數(20.06±1.11)kg/m2;小學至初中18例,高中26例,大專至以上16例。納入標準[5]:患者及家屬均知情同意;均通過病理檢驗確診;已婚或存在性生活史;意識清楚,有基本的聽說讀寫能力。排除標準:有宮頸手術史或者子宮切除史;妊娠或者哺乳期女性;精神疾病、認知障礙或者溝通障礙者;中途退出試驗者。

1.2方法 收集患者宮頸分泌物標本,置于2～8℃下保存,72h之內檢測。(1)薄層液基細胞學檢查:選擇ThinPrep 2 000制片系統對患者標本進行液基薄層細胞制片技術處理,妥善固定并染色后實施鏡檢。將獲得的結果通過TBS系統進行細胞分類,鱗狀細胞包含:正常、鱗狀細胞癌(SCC)、未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細胞(ASCUS)、高度鱗狀上皮內病變(HSIL)、腺癌(AC)、低度鱗狀上皮內病變(LSIL)。(2)病理學檢查:選擇陰道鏡進行多點活檢,宮頸組織分類包含:正常或炎癥、異型上皮細胞限制于宮頸上皮的下1/3(CINⅠ)、異型上皮細胞累及宮頸上皮的下1/3～2/3(CINⅡ)、異型上皮細胞超出宮頸上皮全層的2/3或累及全層宮頸腺但未突破基底膜(CINⅢ)、浸潤癌。(3)制備HPV E6/E7 mRNA:參考國家標準規定的標準品制備及驗證方式,并通過測序驗證,其中PCR模板為14種高危HPV全基因組參考品。(4)轉錄介導等溫核酸擴增技術:選擇轉錄介導等溫核酸擴增技術測定各個高危HPV E6/E7 mRNA,并遵照說明書要求進行檢測。(5)多重實時熒光定量PCR技術:選擇TIANamp Virus DNA/ RNA Kit將RNA進行提取,并按說明書要求操作,通過DEPC水(50 μL)洗脫。將提取到的RNA和2×DNase Ⅰ buffer、DNase Ⅰ混合,37℃條件下30 min。此次反應總體積40 μL,引物和探針信號分別是:16F,AAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAA;16P,CAAAGACATCTGGACAAAA;16R,GACCCCTTATATTATGGAATCTTTGC;18R,TGGCTTCACACTTACAACACATACA;18F,CCGACGAGCCGAACCA;18P,AACG TCACACAATGTT;31R,GGATGTGTCCGGTTCTGCTT;31F,CGACAGCTCAGATGAGGAGGAT;31P,TCATAGACAGTCCAGCTGG等。反應條件:40℃條件下30 min,80℃條件下2 min,95℃條件下2 min,重復40次,最后在72℃時收集熒光信號,并將反應于LightCycler 480 PCR 儀上進行,按循環閾值(Ct)<38判定成標本和內參陽性的閾值,如若Ct>38即標本不合格。(6)靈敏度及特異度:從HPV E6/E7 mRNA標準品內提取RNA,并通過數字PCR進行定量,按照檢測的拷貝數使用含有人基因組的TE溶液遵照十倍梯度進行稀釋,各個梯度中選擇RNA(2μL)作為模板開展多重實時熒光定量PCR反應,測定其靈敏度,同時各個梯度反復測定20次,若19次為陽性的濃度梯度即可成為檢出限。另外選擇 TIANamp Virus DNA/ RNA Kit提取大腸埃希菌、取淋病奈瑟菌、梅毒螺旋體、金黃色葡萄球菌等,選擇2μL作為模板,開展多重實時熒光定量PCR反應,測定其特異度。

1.3觀察指標 比較薄層液基細胞學和病理學檢查結果,并觀察所有患者多重實時熒光定量PCR技術的檢測結果,計算其符合率、靈敏度及特異度。

2 結 果

2.1多重實時熒光定量PCR的靈敏度及特異度 經檢測發現,HPV 16、18、31、33等九類型的最低檢測為10 copies/μL,但HPV 51、52、56、58等五類型最低檢測是100 copies/μL。另外通過多重實時熒光定量PCR檢測高危HPV E6/E7 mRNA和生殖道內常見病原菌例如大腸埃希菌、取淋病奈瑟菌、梅毒螺旋體、金黃色葡萄球菌等,其結果均顯示陰性,且檢測結果的特異性良好。

2.2所有患者的檢查結果分析 薄層液基細胞學的檢查結果與病理學檢查并無差別(P>0.05)。見表1。

表1 所有患者的檢查結果分析[n=60,n(%)]

2.3不同技術的檢測結果分析 多重實時熒光定量PCR技術的符合率91.67%(55/60),靈敏度83.33%(15/18),特異度95.24%(40/42)。見表2。

表2 不同技術的檢測結果分析

3 討 論

目前,臨床對于HPV E6/E7 mRNA的檢測方式較多,例如Hologic Gen-Probe的Aptima HPV Assay作為美國食品藥品監督管理局批準測定高危HPV的方式,但其檢查設備通常呈現封閉式,在國內的普及率較低[6-7]。而PRETECT HPV-Proofer可檢測的型別較少,僅可對五種高危HPV E6/E7 mRNA進行檢測[8]。近些年,隨著醫療技術的持續進步,發現Kodia的高危HPV E6/E7mRNA定量檢測成為國內批準的產品,主要利用b-DNA 信號放大法,但操作方法較復雜,且檢測時間較長,直接限制其在臨床的應用[9-10]。

本文則是基于多重實時熒光定量PCR技術進行HPV E6/E7 mRNA檢測,發現其不僅能夠檢測多達十幾種的高危HPV E6/E7 mRNA,同時操作較為簡便,明顯縮短檢查時間[11-12]。故此,本文比較基于多重實時熒光定量PCR技術和轉錄介導等溫核酸擴增技術,結果發現HPV 16、18、31、33等九類型的最低檢測為10 copies/μL,但HPV 51、52、56、58等五類型最低檢測是100 copies/μL;另外通過多重實時熒光定量PCR檢測高危HPV E6/E7 mRNA和生殖道內常見病原菌例如大腸埃希菌、取淋病奈瑟菌、梅毒螺旋體、金黃色葡萄球菌等,其結果均顯示陰性,且檢測結果的特異性良好;薄層液基細胞學的檢查結果與病理學檢查并無差別(P>0.05);多重實時熒光定量PCR技術的符合率91.67%(55/60),靈敏度83.33%(15/18),特異度95.24%(40/42),提示隨著細胞學病變程度的日益加重,高危HPV E6/E7 mRNA的檢出率也明顯增加,從而證實HPV E6/E7 mRNA轉錄水平和宮頸病變的嚴重程度息息相關。

綜上所述,基于多重實時熒光定量PCR技術在HPV E6/E7 mRNA檢測中意義重大,存在較高的靈敏度及特異度,可成為宮頸病變篩查的主要方式。