hUMSCs外分泌蛋白治療實驗性自身免疫性葡萄膜炎模型大鼠的機制初探*

劉玨， 謝希婷，2， 沈樹浩， 王穎薇， 穆亞君， 陳劍， 周清△

（1暨南大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510630；2深圳深東愛爾眼科醫院，廣東 深圳 518116）

葡萄膜炎是多發于青壯年的常見致盲性眼病，約2/3的葡萄膜炎患者出現慢性視力損傷［1］，在發展中國家致盲率高達25%［2］。自身免疫因素是非感染性葡萄膜炎發病機制的重要基礎［3］，目前治療葡萄膜炎較為普遍的療法是長期全身使用皮質類固醇藥物或免疫抑制劑，治療效果不穩定，而治療引發的眼部并發癥及全身副作用限制了此類藥物的應用［4］，開發安全有效的治療方法是葡萄膜炎研究領域重要而緊迫的社會目標。間充質干細胞（mesenchymal stem cells， MSCs）是一類具有自我更新和分化潛能的細胞，可以通過影響全身Th細胞和Treg細胞及其細胞因子的分泌［5］，減輕EAU的嚴重程度，是實驗性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis， EAU）動物模型治療方案中的突破點［6］。但在局部微環境下，MSCs存在異常分化［7］、促進腫瘤細胞增殖和遷移［8］以及引起增殖性視網膜病變［9］等作用。MSCs外分泌蛋白具有MSCs免疫調節作用的生物活性，同時避免了MSCs的副作用［10］，可作為取代MSCs的治療方案。目前針對MSCs外分泌蛋白在EAU模型中的免疫調節作用，以及MSCs外分泌蛋白是否影響眼球“免疫赦免防線”——血-視網膜屏障（blood-retina barrier， BRB）的相關研究仍有許多未知區域，發掘探討這些內容可為EAU模型的非細胞治療方案提供參考。本實驗應用腹腔注射人臍帶間充質干細胞外分泌蛋白（human umbilical cord mesenchymal stem cells-derived secretome， hUMSCs-S）對EAU模型大鼠進行治療，通過檢測眼內炎癥細胞浸潤、視網膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelial，RPE）緊密連接蛋白及血清中相關炎癥因子的表達，探討 hUMSCs-S是否可以干預EAU的發生和發展其可能的作用機制，以期為EAU的治療提供補充依據。

材料和方法

1 動物

6~8周齡SPF級雌性健康Lewis大鼠72只，體重160~180 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（質量合格證編號No. 99410000001387； No.11400700386749），許可證號為SYXK（粵）2017-0174，動物實驗編號為No. 00220089和 No.00229138；實驗方案和實驗過程經暨南大學實驗動物福利倫理委員會審批及全程監督，批準編號為IACUC-20190303-04和IACUC-20190705-02。

2 主要試劑

提取原代人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells， hUMSCs），培養至P3代收集提取hUMSCs-S。該部分實驗由暨南大學再生醫學實驗室團隊執行，hUMSCs-S由暨南大學再生醫學實驗室提取鑒定并惠贈。

視網膜光感受器間維生素A類結合蛋白（interphotoreceptor retino-binding protein， IRBP）由上海生物工程有限公司合成；弗氏完全佐劑（Freund′s complete adjuvant， CFA）購自Sigma；氨基甲酸乙酯購自上海麥克林生化科技有限公司；眼球固定液購自武漢谷歌生物科技有限公司；大鼠白細胞介素17（in-terleukin 17， IL-17）/IL-17A ELISA Kit購自欣博盛生物科技有限公司；DMEM低糖培養液購自Gibco，蘇木素-伊紅染液購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；CD3抗體及緊密連接蛋白ZO-1抗體購自Abcam；PBS磷酸緩沖液干粉購自Biosharp。

3 主要方法

3.1 hUMSC-S的提取及鑒定 使用組織塊消化法提取hUMSC-S，置于37℃、5% CO2培養箱培養至P3代，24 h后收集上清液，1 000 kD透析袋密封上清液，超純水中透析，每3 h更換1次透析外液，透析24 h后用0.22 μm過濾器除菌并收集透析液。提取外分泌蛋白后用BCA法測試其蛋白濃度，Zeta電位儀檢測Zeta電位。隨機抽取10批次的外分泌蛋白混合后進行質譜檢測。-80 ℃下保存備用。

3.2 實驗分組與模型制作 排除全身及眼部異常，動物按序編號，用隨機數字表法將實驗動物隨機分為正常對照（control， CTRL）組、EAU模型組及hUMSCs-S治療組，每組24只大鼠。參照Caspi的方法建立EAU動物模型并制備造模藥物［11］，IRBP與CFA（含2.5 g/L結核分枝桿菌）混合震蕩1 min制成乳液（0.2 mL含50 μg IRBP ）。EAU模型組及hUMSCs-S治療組組：每只大鼠尾根部及雙側大腿皮下注射乳液0.2 mL（尾部注射0.1 mL、雙側大腿皮下注射各0.05 mL），CTRL組大鼠相同部位注射等體積PBS緩沖液；hUMSCs-S治療組大鼠在免疫誘導的同時按100 μg/100 g體重腹腔注射hUMSCs-S懸液，CTRL組和EAU模型組腹腔注射等體積PBS緩沖液。

3.3 眼前段Caspi評分 建模后每日在裂隙燈顯微鏡下觀察并拍攝記錄大鼠眼前段情況，共觀察21 d，根據Caspi評分標準［12］評價眼前段炎癥程度。

3.4 眼球組織切片HE染色及病理學觀察 于第7、14和21天隨機抽取3組大鼠各8只，20%氨基甲酸乙酯按1.5 mL/kg體重腹腔注射麻醉大鼠，待充分麻醉后斷頸處死大鼠，Ⅲ型安爾碘消毒眼周皮膚，用無菌眼科顯微器械分離眼球與瞼結膜等周圍組織，剪斷眼球遠端視神經及血管，完整摘除雙側眼球，固定并制成石蠟切片行HE染色，根據Caspi組織病理學分級評分［12］，用顯微鏡（Leica DM4000）拍攝全眼球切片，每張切片選取前房睫狀突附近3個視野進行觀察，采用ImageJ軟件對前房浸潤炎癥細胞進行計數，拍攝及計數分析由兩名經驗豐富的眼科專業研究人員同時操作。

3.5 免疫組化檢測 CD3+T細胞及免疫熒光檢測ZO-1蛋白 眼球組織切片經過脫蠟、抗原修復、雙氧水處理、血清封閉后，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育50 min，DAB顯色、蘇木素染核、脫水封片，鏡下觀察棕黃色著色細胞為CD3陽性表達。各組大鼠眼球石蠟切片經過脫蠟、抗原修復、血清封閉后，滴加ZO-1 Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育2 h、DAPI染細胞核后封片，-20 ℃避光保存，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

3.6 ELISA檢測外周血IL-10、IL-17水平 第14天時隨機抽取3組大鼠，先進行上述3.4步驟取材，隨后開腹采集腹主動脈血3~5 mL，將血液標本置于37 ℃水浴鍋中孵育1 h，2 000 ×g離心10 min后取上清，釆用ELISA試劑盒檢測IL-10、IL-17水平。

4 統計學處理

采用SPSS 27.0統計學軟件對實驗數據進行統計分析，實驗數據以均數±標準差（mean±SD）表示，EAU模型組與hUMSCs-S治療組大鼠眼部炎癥Caspi評分采用兩樣本t檢驗分析，血清中IL-10、IL-17表達量差異比較使用單因素方差檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1 hUMSCs-S蛋白質譜分析鑒定

BCA蛋白定量檢測結果顯示有血清存在條件下提取液中的蛋白濃度約為3.690 mg/mL，無血清條件下提取的蛋白濃度為0.598 mg/mL。蛋白質譜分析結果顯示hUMSC-S中含蛋白質共379種，其中包括ICOS配體、vasorin、protein sidekick-2、moesin、retinal dehydrogenase-1、caspase recruitment domain-containing protein 16及各型免疫球蛋白等與免疫反應相關和視網膜損傷及修復過程相關的蛋白成分。

2 眼前段炎癥觀察及Caspi評分

CTRL組大鼠眼前節表現為角膜透明，虹膜紋理清晰，虹膜血管無明顯充血擴張，瞳孔等大等圓，對光反射靈敏，眼底紅光反射存在，見圖1A：a~d。EAU組造模后第7天開始可觀察到虹膜表面血管擴張、充血（圖1A：f）；第14天眼前段炎癥加重達高峰，虹膜表面血管進一步擴張、充血，房水混濁，瞳孔區虹膜后粘連或閉鎖（圖1A：g），眼底紅光反射變暗，嚴重者出現前房積血；第16~18天眼前段炎癥減輕，造模后第21天前段炎癥消退，個別模型可見虹膜血管輕度充血（圖1A：h）。

Figure 1. Anterior chamber performance and Caspi score of the rats in the 3 groups. A： anterior chamber images at various time points： the day of modeling （D0）， the 7th day （D7）， the 14th day （D14）， and the 21st day （D21）. Vascular dilation and congestion on the surface of the iris could be observed since D7 after modeling in the EAU group （f）. Blood vessels on the surface of the iris were further dilated and congested， with cloudy aqueous humor， and atretopsia on the D14 （g）. hUMSCs-S group exhibited less inflammation in the anterior segment than EAU group， with onset of congestion and dilation of iris vessels on D7 （j）， and mild turbidity of aqueous humor on D14 （k）. The anterior segment basically returned to normal on D21 （h， l）. Scale bar=2 mm. B： anterior chamber Caspi score of rats in EAU and hUMSCs-S group. Mean±SD. n=8. *P<0.05， **P<0.01 vs huMSCs-S group.圖1 3組大鼠眼前段表現及眼前段Caspi評分

hUMSCs-S治療組眼前段炎癥表現較EAU模型組輕， 第7~10天起病，第13~14天病變達高峰，觀察到虹膜血管充血、擴張，房水混濁；其后炎癥逐漸消退，至第21時眼前節基本恢復正常，見圖1 A：i-l。

EAU模型組及hUMSCs-S治療組大鼠前房Caspi評分，采用兩樣本t檢驗進行分析，結果顯示EAU組眼前段Caspi評分均數在第11~17天均高于hUMSCs-S組（P<0.05），見圖1B。

3 眼球組織切片HE染色及組織病理學分析

觀察第7天、第14天、第21天3個時間點各組大鼠眼球組織石蠟切片HE染色情況，其前房、虹膜睫狀體、視網膜病理學改變、前房及玻璃體炎癥細胞浸潤情況與眼前段炎癥改變時間段及炎癥程度一致。

CTRL組虹膜、視網膜及前房結構完整、分層有序，無水腫及炎癥細胞浸潤（圖2A：a、d、g）。EAU組在第7天出現虹膜及視網膜水腫、前房和玻璃體腔炎癥細胞浸潤；第12~14天達高峰，虹膜血管擴張、充血，虹膜及前房大量炎癥細胞浸潤（圖2A：b、h）、視網膜分層結構紊亂（圖2A：e）；第21天病變消退，結構基本恢復正常，炎細胞浸潤減少，極少數模型遺留視網膜結構紊亂。hUMSCs-S組虹膜及視網膜組織輕度水腫（圖2A：c、f）、虹膜及前房少量炎癥細胞浸潤（圖2A：c、i），破壞程度較EAU組明顯減輕，第21天虹膜及視網膜結構均恢復正常。第14天時EAU模型組視網膜損傷Caspi評分均數高于hUMSCs-S治療組（P<0.01），見圖2B。EAU組前房滲出細胞數明顯高于CTRL組和hUMSCs-S組（P<0.05），見圖2C。

Figure 2. HE staining of iris， retina and anterior chamber， retinal Caspi score and anterior chamber infiltrating inflammatory cells onthe 14th day after modeling of three groups of rats. A： HE staining of iris， retina and anterior chamber. Iris， retina and anterior chamber were intact， stratified and orderly without edema or inflammatory cell infiltration in the CTRL group （a， d，g）. In the EAU model group， edema of the iris and retina， infiltration of a large number of inflammatory cells in the iris，anterior chamber， dilation and congestion of the iris blood vessels， and disorders of retinal stratification were observed （b，e， h）. In the hUMSCs-S group ， there was mild edema of iris and retina tissues as well as a small amount of inflammatory cell infiltration in iris and anterior chamber （c， f， i）. Scale bar=100 μm. B： statistical results of retinal tissue Caspi scores between the EAU group and the hUMSCs-S group at days 7， 14 and 21. C： infiltrating cells of the anterior chamber in the three groups at D14 were analyzed. Mean±SD. n=8. *P<0.05， **P<0.01 vs CTRL group； ##P<0.01 vs EAU group .圖2 造模后第14天3組大鼠虹膜、視網膜及前房組織HE染色結果，視網膜Caspi評分及前房滲出炎癥細胞計數

4 眼球免疫組化檢測CD3+ T細胞及免疫熒光檢測ZO-1蛋白

CTRL組虹膜睫狀體及視網膜可見少量CD3+T細胞表達；EAU模型組虹膜睫狀體有大量CD3+T細胞陽性表達，視網膜的外核層、內核層、內叢狀層及節細胞層及脈絡膜層均可見陽性細胞。hUMSCs-S治療組虹膜睫狀體及視網膜的CD3+T淋巴細胞的表達較EAU組明顯減少。

CTRL組ZO-1蛋白在視網膜明顯表達；EAU模型組在第14天時視網膜及脈絡膜的ZO-1明顯減少，以視網膜內層及色素上皮層缺失明顯；hUMSCs-S治療組視網膜內層ZO-1表達較CTRL減少，但仍多于EAU模型組，見圖3。

Figure 3. Immunohistochemistry staining of CD3+ T-lymphocytes and immunofluorescence staining of ZO-1 in iris and retina of the three groups at D14 after modeling. A small amount of CD3+ T cells were observed in iris，ciliary body and retina in CTRL group （a， d）. In EAU group， a large number of CD3+ T cells were positively expressed in the iris， ciliary body， anterior chamber and the retina （b， e）. The expression of CD3+ T lymphocytes in iris ciliary body and retina of hUMSCs-S group was significantly reduced compared with EAU group （c， f）. ZO-1 protein was obviously expressed in retina in CTRL group （g）. In the EAU group， ZO-1 levels in retina decreased significantly，especially in the inner retina and retinal pigment epithelium （h）. The expression of ZO-1 in the inner retina of hUMSCs-S was lower than that of CTRL， but still higher than that of EAU group （i）.圖3 造模后第14天3組大鼠虹膜、視網膜CD3+ T淋巴細胞免疫組化染色及ZO-1免疫熒光染色結果

5 ELISA檢測大鼠外周血IL-17、IL-10濃度

采用ELISA試劑盒對3組大鼠第14天時外周血中IL-17、IL-10水平進行檢測。結果顯示，EAU模型組外周血清中IL-17表達組較CTRL組和hUMSCs-S治療組均增加（P<0.01），見圖4A； EAU模型組血清中IL-10表達水平高于CTRL組（P<0.01），hUMSCs-S治療組血清中IL-10表達水平高于EAU模型組（P<0.05），見圖4B。

Figure 4. Concentrations of IL-17 （A） and IL-10 （B） in peripheral blood of rats in 3 groups at D14 after modeling.mean±SD. n=8. **P<0.01 vs CTRL group； #P<0.05，##P<0.01 vs EAU group.圖4 造模后第14天3組大鼠外周血中IL-17和IL-10濃度

討論

本實驗應用IRBP聯合弗氏完全佐劑成功誘導EAU大鼠模型，在誘導免疫的同時給予腹腔注射hUMSCs-S，結果顯示腹腔注射hUMSCs-S可使EAU大鼠眼前段炎癥緩解、前房浸潤炎癥細胞數量減少，視網膜損傷程度減輕，證明腹腔注射hUMSCs-S對大鼠EAU治療有效。

BRB的完整性與眼內炎癥反應程度關系密切，EAU時BRB被破壞，白細胞黏附，血管通透性增加，炎癥細胞及相關因子透過屏障浸潤至視網膜，引起視網膜組織水腫、炎癥細胞浸潤和新生血管生成。BRB的完整性和眼部微血管通透性的維持主要依賴于緊密連接蛋白的表達，即ZO-1緊密連接蛋白，其表達可反應BRB的完整性。實驗結果提示，ZO-1蛋白在CTRL組大鼠視網膜表達明顯；在造模第14天時EAU組大鼠視網膜及脈絡膜相應區域淡染甚至無染色、CD3+T細胞大量表達；hUMSCs-S治療組大鼠視網膜內層ZO-1表達較CTRL組減少，較EAU模型組表達量增加，表明腹腔注射hUMSCs-S可通過減輕EAU模型大鼠視網膜即脈絡膜ZO-1蛋白破壞程度維持視網膜結構完整性。

研究表明，Th17細胞分泌的IL-17在EAU模型動物的虹膜睫狀體、視網膜及脈絡膜組織中均有表達，其表達量與病變程度正相關［13］，而作為EAU中Th1分泌的主要促炎因子，IFN-γ基因敲除鼠仍可由IL-17誘導發生EAU［14］，IL-17特異性抗體可明顯減輕EAU癥狀［15］；說明IL-17是EAU發病機制中更為重要的因子。現有對MSCs及其外分泌蛋白治療EAU模型的機制研究多集中在抑制眼球局部T細胞增殖分化，減少IL-17的表達，上調Treg細胞占比等方面；IL-17在EAU病理機制中的作用還包括破壞ARPE-19細胞（人視網膜上皮細胞）的ZO-1緊密連接蛋白，刺激其分泌炎癥介質［16］，吸引活化白細胞進一步加重損傷［17］。目前應用MSCs-S治療EAU的給藥方式一般采取眼周局部注射或玻璃體腔注射。在本實驗中，第14天時EAU模型組大鼠外周血中促炎因子IL-17的表達水平較CTRL組增加，經腹腔注射hUMSCs-S的EAU大鼠外周血IL-17表達水平較EAU組下降，但與CTRL組比較仍有增加。

IL-10是調節性免疫細胞分泌的抑炎因子。體外實驗證實，經MSC分泌的微囊泡處理的激活狀態BV2細胞及外周血單核細胞表達抑炎因子IL-10和TGF-β總量增加，同時炎性細胞因子（TNF-α和IL-1β）的表達減少［18］；MSCs-S治療可顯著提高神經退行性病變［19］及慢性炎性疾病模型（如多發性硬化［20］、實驗性自身免疫性腦脊髓炎［21］和1型糖尿病［22］）動物體內損傷組織、外周淋巴器官及血清中表達IL-10的Treg細胞比例；細胞及動物實驗證實MSCs-S抑炎作用的主要機制為通過抑制漿細胞分化，誘導Breg細胞表達IL-10，進而減輕炎癥［23］。外周血中IL-10表達的調控在EAU治療中的作用未見報道，本實驗探討了hUMSCs-S對EAU模型外周血中IL-10的影響，實驗結果證實，與腹腔注射PBS的EAU組相比，腹腔注射hUMSCs-S組大鼠外周血中抑炎因子IL-10表達明顯升高。提示腹腔注射hUMSCs-S可提高外周血中抑炎因子IL-10的表達。

綜上所述，在IRBP聯合弗氏完全佐劑誘導的EAU大鼠模型中，眼球內ZO-1緊密連接蛋白的表達減少會導致BRB的破壞、炎癥細胞浸潤、導致視網膜炎癥的產生，腹腔注射hUMSC-S可以通過減少ZO-1蛋白的破壞達到維持BRB穩定性、減少炎癥細胞浸潤的作用。腹腔注射hUMSCs-S后EAU大鼠外周血中炎癥因子IL-17表達下降、抑炎因子IL-10的表達增加與EAU緩解程度一致，說明hUMSCs-S除能夠有效穿透組織和生物屏障，在眼球局部發揮作用外，還可能通過在全身發揮抑炎、調節免疫作用同步發揮調節炎癥免疫的作用。使用hUMSC-S可以有效地抑制模型大鼠EAU炎癥反應。在實際應用中，相對于間充質干細胞來源緊缺及導入機體方式不完善等限制，hUMSC-S具有來源廣泛，分離提取技術成熟，獲取存儲較易的優點，本實驗的完成為異源性MSCs外分泌蛋白全身給藥治療大鼠EAU提供了證據，腹腔注射hUMSCs-S有潛力成為EAU干細胞治療中重要的補充手段。