N-Ac-PGP通過激活TLR4誘導巨噬細胞的M1極化并提高慢性阻塞性肺疾病炎癥水平*

劉倩， 楊姣▲， 石西南， 徐悅， 杜曉華△

（1昆明醫科大學第一附屬醫院，云南 昆明 650032；2云南中醫藥大學，云南 昆明 650500）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease， COPD）是一種漸發性疾病，主要由吸入刺激性物質引起呼吸道炎癥反應，從而導致氣流受阻和氣管粘膜上皮病變［1-2］。該病在全球范圍內發病率和死亡率較高，且目前只有對癥的保守治療方法，例如減少吸入刺激物、增加適量運動、減輕炎癥反應等［3］。COPD發病的分子機制很復雜，多種炎性細胞參與了COPD的發病過程。研究顯示，在COPD患者的呼吸道組織中，巨噬細胞數量比健康組織高5-10倍，并且巨噬細胞的極化對于COPD的炎癥反應有決定性作用［1，4］。進一步的研究觀察，巨噬細胞中CD86的表達增加是許多炎性疾病發展的重要因素［5］。同時，CD86和iNOS等的增加，CD11b和CD45等的減少與M0巨噬細胞向M1型的轉化有關［6］。研究報道，在LPS誘導的急性肺損傷中，巨噬細胞的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4， TLR4）表達顯著增強［7］。此外，巨噬細胞還可與香煙煙霧中的某些提取物相結合誘導TLR2和TLR4通路的激活，加重肺細胞的損傷，提高炎癥水平［8］。呼吸道內TLR4信號通路激活會釋放炎性物質，誘導大量炎性因子釋放，并聚集巨噬細胞使其向促炎型的M1型極化，加重COPD的病情［9］。由于COPD患者肺組織中的巨噬細胞吞噬功能存在缺陷，未被清除的細菌、凋亡的細胞和一些化學物質持續刺激呼吸系統，導致炎癥持續存在［10］。

N-乙酰化脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸（N-acetylated proline-glycine-proline， N-Ac-PGP）是由肺部的慢性炎癥和肺泡損傷過程中由膠原蛋白經基質蛋白酶降解產生的活性三肽［11］。腰椎間盤中的N-Ac-PGP誘導軟骨終板干細胞骨架重排和促炎表型分化，最終促進退行性椎間盤的炎癥反應［12］。此外，在COPD患者的痰液和血清中均檢測到N-Ac-PGP的表達［13］，同時被發現N-Ac-PGP存在于COPD的炎癥反應中，因此將N-Ac-PGP視為COPD潛在的生物標志［14］。研究表明，N-Ac-PGP與IL-8的結構和功能相似，可以通過趨化作用將炎性細胞聚集到損傷組織，進一步加重組織的炎癥反應促進COPD的發展［15］。據報道，中性粒細胞是慢性炎癥的先天免疫細胞，可以被N-Ac-PGP誘導到肺組織炎癥部位。但是，N-Ac-PGP在COPD中調節巨噬細胞表型促進炎癥的研究還未見報道。

人單核細胞白血病細胞系THP-1被廣泛運用于巨噬細胞功能、機制和通路的研究中。根據以前的實驗研究，使用佛波脂（phorbol 12-myristate 13-acetate， PMA）誘導處理便能將THP-1細胞轉化為M0型巨噬細胞［6］。本研究采用N-Ac-PGP處理M0型巨噬細胞，分析N-Ac-PGP對M1型巨噬細胞誘導的機制。TLR4的異常表達與COPD的炎癥有關，故探究N-Ac-PGP是否通過TLR4誘導巨噬細胞M1極化從而促進COPD炎癥反應，為減輕COPD的炎癥和免疫失調提供參考資料。

材料和方法

1 實驗材料

THP-1細胞購于中國科學院昆明動物研究所細胞庫；10%胎牛血清、雙抗、DMEM培養液和反轉錄試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；TRIzol RNA提取液和脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）購自Invitrogen；PMA購于Sigma-Aldrich；N-AC-PGP購自南京肽谷生物科技有限公司；TLR4抑制劑TAK-242購自AbMole BioScience；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL試劑、Ⅰ抗、Ⅱ抗和ELISA檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

2 方法

2.1 痰液樣本納入及分組 收集2022年8~12月我院呼吸內科因COPD而入院治療病人13例作為研究對象，納入符合以下標準的患者：（1）患者病情穩定，近3月病情未惡化；（2）無嚴重心腦血管疾病；（3）無自身免疫疾病；（4）無惡性腫瘤放化療。對照組納入經肺功能和電子支氣管鏡檢查無異常發現者10例作為研究對象，兩組在年齡和性別方面的差異均無統計學意義（P>0.05）。根據痰液誘導標準方法［16］，霧化前生理鹽水清理鼻腔，誘導前15 min吸入200 μg沙丁胺醇，霧化吸入3%高滲鹽水以5 min微間隔持續15~20 min，咳出痰液，收集于無菌干燥培養皿中。合格痰液標本使用0.9%的鹽水按1∶1稀釋，置于-80 ℃冰箱保存。所有受試者均遵循自愿參加原則，簽署知情同意書，并經過昆明醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準。

2.2 電噴霧離子化-液相色譜-質譜/質譜（electrospray ionization-liquid chromatrography-mass spectrum/mass spectrum， ESI-LC-MS/MS）檢測人痰液中N-Ac-PGP含量 取痰液樣本進行質譜分析。使用配備Shimadzu HPLC的MDS Sciex API-4000光譜儀（Aplied Biosystems）測量N-Ac-PGP。采用2.1×150 mm Develosil C30色譜柱進行HPLC（緩沖液A：0.1%甲酸，緩沖液B：乙腈加0.1%甲酸；0~0.6 min內80%緩沖液A/20%緩沖液B，0.6~5 min內0%緩沖液A/100%緩沖液B）。用100%異丙醇/0.1%甲酸沖洗去除背景。N-Ac-PGP的正電噴霧質量躍遷為312-140和312-112。

2.3 ELISA檢測COPD患者痰液炎性細胞因子白細胞介素1α（interleukin-1α， IL-1α）和IL-12的表達 痰液離心，取上清液，用ELISA試劑盒按說明書測量細胞因子IL-1α和IL-12的表達量。

2.4 細胞培養及分組 THP-1細胞接種于含10%胎牛血清、1%抗生素（1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素）的DMEM培養液中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。將細胞分成THP-1組（正常培養的THP-1細胞）、PMA組/M0組（使用10 μg/L的PMA處理THP-1細胞24 h，誘導THP-1細胞分化為M0型巨噬細胞［17］）、PMA+LPS組/LPS組（使用100 μg/L LPS處理M0型巨噬細胞24 h，進一步誘導M0型巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞［18］）、N-Ac-PGP組（使用1 μg/L N-Ac-PGP處理M0型巨噬細胞24 h）和N-Ac-PGP+TAK-242組（使用TLR4抑制劑TAK-242和N-Ac-PGP同時處理M0型巨噬細胞，培養24 h）。

2.5 RT-qPCR檢測CD11b、CD45、CD86和誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）的mRNA表達水平 Trizol法提取收集各組細胞總RNA，DNA酶處理后按反轉錄試劑盒說明書反轉錄。取2 μL cDNA放入EP管為模板，采用SYBR Green Master Mix反應體系進行擴增，擴增體系為20 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環40次。以GAPDH為內參照，檢測目的基因的相對表達。測定模板Ct值，2-ΔΔCt法定量相對表達量。引物由昆明擎科生物科技有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

2.6 Western blot檢測CD11b、CD45、CD86和iNOS蛋白表達水平 收集各組巨噬細胞，用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解細胞，加入胰酶裂解蛋白，用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度。10%SDS-PAGE分離蛋白樣本，電轉印法將蛋白轉印至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉封膜處理1小時。加入稀釋好的Ⅰ抗4 ℃孵育過夜；次日，去除Ⅰ抗，TBST清洗3次后，加入Ⅱ抗室溫孵育2小時。最后進行ECL顯色，凝膠成像采集儀收集圖像，使用ImageJ分析圖像灰度值。

2.7 ELISA檢測腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、IL-1β、IL-23和IL-6的水平 收集各組細胞上清液，使用ELISA檢測試劑盒，按說明書對細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23的含量進行檢測，繪制標準曲線，計算各個細胞因子的含量。

3 統計學處理

使用SPSS 22.0進行統計分析，所得數據以平均數±標準差（mean±SD）表示。使用Pearson相關系數（r）測試痰液樣本中變量之間的關系。兩組間差異比較采用t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1 COPD患者痰液中檢測到N-Ac-PGP，且與患者痰液中細胞因子IL-α和IL-12顯著相關

ESI-LC-MS/MS檢查10名對照者和13名COPD患者的誘導痰中的N-Ac-PGP，有11名COPD患者痰液中N-Ac-PGP高出檢出限呈陽性，而對照者痰液中N-Ac-PGP呈陰性（圖1A）。ELISA檢測觀察到IL-1α和IL-12在COPD患者中高表達（圖1B、C）。COPD患者痰液中的N-Ac-PGP水平與IL-1α和IL-12的表達水平呈顯著正相關（圖1D、E）。

Figure 1. The detection results of sputum samples. A： N-Ac-PGP was measured by ESI-LC-MS/MS with a detection limit of 10 ng/L（dashed line）； B and C： the expression of IL-1α and IL-12 in the sputum was detected by ELISA； D and E： the correlation between N-Ac-PGP and IL-12/IL-1α in the sputum of COPD patients was measured by Pearson analysis. Mean±SD. n=10 in control group； n=13 in COPD group. *P<0.05， **P<0.01 vs control group.圖1 痰液樣本檢測結果

2 M0和M1型巨噬細胞模型的構建情況

RT-qPCR和Western blot結果顯示，與THP-1和PMA+LPS組相比，PMA組M0型巨噬細胞表面標志蛋白CD11b和CD45的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）；PMA組M1型巨噬細胞表面標志蛋白CD86和iNOS的mRNA和蛋白表達水平與THP-1組相比無顯著差異（P>0.05），但PMA+LPS組CD86和iNOS的mRNA和蛋白表達水平均較其他兩組顯著升高（P<0.01），見圖2。

Figure 2. The mRNA and protein expression levels of M0 and M1 macrophage surface markers. A： the mRNA expression levels detected by RT-qPCR； B： the protein expression levels detected by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs THP-1 group； #P<0.05， ##P<0.01 vs PMA group.圖2 M0和M1型巨噬細胞表面標志物的mRNA和蛋白表達

3 N-Ac-PGP促進M0型巨噬細胞向M1型極化

RT-qPCR和Western blot結果顯示，與M0組相比，LPS和N-Ac-PGP處理M0型巨噬細胞后M1型巨噬細胞表面標志物CD86和iNOS的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），見圖3A、B。ELISA結果顯示，LPS組和N-Ac-PGP組細胞上清液中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23的含量與M0組相比均顯著增多（P<0.01），見圖3C。

Figure 3. Treatment with N-Ac-PGP promoted the polarization of M0 macrophages to M1-type. A： the mRNA expression levels detected by RT-qPCR； B： the protein expression levels detected by Western blot； C： the expression of cytokines detected by ELISA. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs M0 group.圖3 N-Ac-PGP處理促進M0型巨噬細胞的M1極化

4 N-Ac-PGP通過TLR4促進M0型巨噬細胞的M1極化

RT-qPCR和Western blot結果顯示，與N-Ac-PGP組相比，N-Ac-PGP與TAK-242聯合處理后M0型巨噬細胞表面標志蛋白CD86和iNOS的mRNA和蛋白表達水平均顯著下降（P<0.05或P<0.01），見圖4A、B。ELISA結果顯示，N-Ac-PGP與TAK-242聯合處理后細胞上清液中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23的含量較N-Ac-PGP組均顯著減少（P<0.05或P<0.01），見圖4C。

Figure 4. Inhibition of the TLR4 pathway by TAK-242 attenuated the promoting effect of N-Ac-PGP on M0 macrophage polarization to M1-type. A： the mRNA expression levels tested by RT-qPCR； B： the protein expression levels detected by Western blot；C： the expression of cytokines detected by ELISA. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs N-Ac-PGP group.圖4 抑制TLR4通路減弱N-Ac-PGP促進M0型巨噬細胞向M1型極化的作用

討論

COPD是一種慢性疾病，早期癥狀不明顯，確診時往往已發展至中晚期，嚴重影響患者的身心健康和家庭生活［19］。COPD發病由炎癥、細胞生長、細胞凋亡、細胞異常修復等多種因素引起［2］。COPD患者的痰液和肺中觀察到的巨噬細胞數量增加，表明巨噬細胞與疾病的嚴重程度有關［20］。研究表明，吸入的刺激物會激活呼吸道內的巨噬細胞M1型極化促進炎癥增加，M1巨噬細胞在分泌炎性細胞因子引起炎癥反應的同時，其較強的吞噬功能也會持續損傷組織［20］。肺部疾病的慢性炎癥會導致肺組織破壞，從而導致趨化性膠原蛋白片段N-Ac-GPG的形成。有學者觀察到香煙煙霧刺激機體產生N-Ac-PGP，NAc-PGP特異性趨化嗜中性粒細胞入侵肺組織，加速肺組織穩態的破壞［24］，但尚未有N-Ac-PGP與巨噬細胞相互作用在COPD中的研究。

本研究初步探討N-Ac-PGP通過激活TLR4促進巨噬細胞M1極化促進COPD的炎癥發生。通過檢測COPD患者痰液樣本中的N-Ac-PGP和M1巨噬細胞的表達情況，觀察到COPD患者痰液中N-Ac-PGP和M1型標志物的表達升高，并且N-Ac-PGP的水平與M1分泌的炎性細胞因子表達水平顯著相關，表明N-Ac-PGP可能通過促進巨噬細胞M1極化促進COPD的炎癥發生。為了進一步探究N-Ac-PGP與COPD炎癥中巨噬細胞M1型極化的聯系，使用LPS和N-Ac-PGP處理M0巨噬細胞，結果表明LPS和NAc-PGP對巨噬細胞M1極化均有促進作用。巨噬細胞M1極化后會釋放IL-23、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細胞因子從而引起一系列炎癥反應［25］。同樣實驗結果顯示TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23等炎性因子表達上調，可見N-Ac-PGP誘導M0巨噬細胞向M1型極化。已有研究表明，TLR4的高表達對巨噬細胞M1極化有促進作用，例如香煙煙霧中的提取物可以通過直接或間接作用與TLR4受體結合，激活TLR4/NF-κB信號通路參與巨噬細胞的M1極化［26］。此外，在COPD中，紫蘇葉提取物或一些藥物通過抑制TLR4通路減輕COPD的氣道炎癥［27］。綜合以上因素，接下來探究TLR4通道對于N-Ac-PGP促進巨噬細胞M1極化的影響。在N-Ac-PGP處理的基礎上采用TLR4抑制劑處理M0細胞，檢測對比巨噬細胞M1極化情況，結果表明TLR4抑制劑對N-Ac-PGP促進的巨噬細胞M1極化有顯著的抑制作用，綜上所述，N-Ac-PGP激活巨噬細胞M1極化促進炎癥需要通過TLR4受體通道。

總之，本研究使用N-Ac-PGP處理M0型巨噬細胞，結果表明N-Ac-PGP對M0型巨噬細胞向M1型極化的有正向調節作用，并通過TLR4通路抑制劑驗證了N-Ac-PGP通過TLR4通路促進巨噬細胞M1極化。