超表達AVP1基因提高甜菜的耐低磷和耐鹽抗旱性

孫亞卿,王曉嬌,2,劉 雪,李寧寧,李國龍,張少英*

(1 內蒙古農業大學 農學院,呼和浩特 010019; 2 內蒙古自治區農牧業科學院,呼和浩特 010031)

甜菜是中國重要的糖料作物,也是內蒙古地區具有地域優勢的經濟作物。得益于生產種植的規模化和機械化,近年來發展勢頭良好,其生產主要分布在北緯40°以北各省區,而該區域鹽堿、干旱土地集中,各種非生物脅迫是制約甜菜產業高質量發展的主要因素之一,因此提高甜菜的抗逆性、保證甜菜產質量穩定提升是保障甜菜生產可持續發展的重要基礎[1]。在傳統育種的基礎上,利用生物技術對其加以遺傳改良,以培育出優質、高產、抗逆性強的新品種,對提高北方地區甜菜產量以及改良和利用大面積鹽堿地和荒漠化土地有重要意義[2-3]。多項研究證明,H+-PPase(H+-焦磷酸酶)基因的過表達可為液泡膜的次級轉運系統提供能量,在多種非生物脅迫適應性中起著重要的作用,包括提高植物細胞對鹽堿和干旱的耐受性。

通過過表達該基因,不僅可促進轉基因植株的根系生長,還可通過分泌有機酸,提高植物根系對磷的吸收效率[4-5]?？梢?H+-PPase基因作為提高作物抗性的候選基因是一個非常具有潛力的有效基因。本研究在已有研究基礎上,將擬南芥H+-PPase基因AVP1對甜菜進行轉化,對獲得的轉基因甜菜植株進行不同非生物脅迫處理(鹽脅迫、低磷和干旱),分析各處理條件下轉基因甜菜的磷吸收能力和抗逆性能,為培育高產、高抗性的甜菜新品種提供參考。

1 材料和方法

1.1 轉基因甜菜的獲得

克隆于擬南芥的AVP1基因和經改造的攜帶AVP1基因的質粒pCAMBIA2301(圖1)由本課題組先期完成,參見王曉嬌[6]方法,利用農桿菌菌株LBA4404,對甜菜品系DF1031進行遺傳轉化。將甜菜種殼打磨后采用10% NaClO和0.1% HgCl2各處理10 min的滅菌劑組合,MS培養基培養獲得無菌苗。甜菜子葉節置于MS+1.0 mg/L 6-BA的分化培養基上預培養2～3 d,用OD600為0.4～0.5的菌液侵染6～8 min,共培養48 h后,轉入含0.1 g/L卡那霉素和0.3 g/L羧芐青霉素的分化培養基(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA)上進行篩選培養。外植體分化出不定芽后,移到生根培養基(1/2 MS+2.0 mg/L NAA)上生根成苗。對得到的抗性苗隨機取樣不同部位,且經PCR和RT-PCR檢測全部為陽性的植株,選取長勢一致的植株用于進一步處理研究。

圖1 質粒pCAMBIA2301示意圖Fig.1 Schematic map of the plasmid pCAMBIA1301

1.2 轉AVP1基因甜菜的分子檢測

1.2.1 轉基因甜菜的PCR檢測

根據所用植物表達載體序列合成引物(表1),擴增長度為600 bp的片段,分別以質粒和野生型植株作為正負對照,用于抗性苗的基因整合鑒定。

1.2.2 轉基因甜菜的qRT-PCR檢測

采用TRIzol方法提取經PCR鑒定陽性甜菜植株組織RNA,純化后的RNA 反轉錄合成cDNA,步驟見王曉嬌方法[6]。用甜菜Actin基因當內參基因(表1),進行熒光定量PCR (quantitative real-time PCR,qRT-PCR),分別計算不同培養條件(低磷、干旱、鹽脅迫)下葉片和塊根中AVP1基因的相對表達量。

1.3 材料準備

對不同甜菜組培苗材料煉苗3～4 d后,將幼苗移入經高壓滅菌過的珍珠巖/細砂/蛭石(1∶1∶1)基質中,遮蔭3～4 d后觀察幼苗生長情況,然后逐漸去除遮蔭網,自然光照射。每2 d澆入1/2霍格蘭營養液,期間溫度和濕度適宜。選取苗高、長勢基本一致的植株作為試驗材料。

1.4 不同磷濃度處理

1.5 干旱脅迫處理

挑選前期培養的長勢基本一致的轉基因和野生型植株幼苗,采用25% PEG 6000進行干旱脅迫,不脅迫為對照,3個重復,在干旱脅迫處理期間,每2 d取1次樣品測定相關指標,每個指標6次重復。

1.6 鹽脅迫處理

挑選上述培養的轉基因和野生型植株幼苗,用l/8霍格蘭營養液澆灌(其中含50 mmol/L NaCl),NaCl濃度每隔1 d增加50 mmol/L,最后達到終濃度200 mmol/L。繼續培養7 d后,取樣測定相關指標,每個指標6次重復。

1.7 指標測定

土壤總磷量采用分光光度法定量測定[7]。植株總磷量采用銻抗比色法[8]。游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮法。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)-分光光度法。

1.8 數據分析

所得數據應用SAS 9.0軟件進行方差分析,利用Excel 2003進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同培養條件下轉基因甜菜AVP1的表達差異

對經PCR檢測鑒定為陽性(圖2)的植株材料,采用qRT-PCR分析其在不同培養條件下甜菜葉片和塊根中AVP1基因表達量的差異。

M. DL3000;1. ddH2O;2. 質粒(CK+);3. 野生型(CK-);4-10. 轉基因甜菜。圖2 T1代轉AVP1基因甜菜 PCR檢測M. DL3000; 1. ddH2O; 2. Plasmid(CK+);3. Wild-type(CK-); 4-10. Transgenic sugar beet.Fig.2 The PCR electrophoretogram of T1 generation AVP1 gene transgenic sugar beet

結果顯示,無論在不同磷處理(圖3)、高鹽和干旱脅迫(圖4)條件下,野生型甜菜葉片和塊根中AVP1基因均未表達,而轉基因甜菜的葉片和塊根中AVP1均有不同程度的表達,其中葉片中的表達量較強。與對照比較,低磷處理下,AVP1基因在葉片和塊根中的表達量均顯著增加,而在高磷處理下,AVP1基因的表達量卻沒有增加,在轉基因甜菜葉片中AVP1基因具有表達優勢。在脅迫條件后,AVP1基因在轉基因甜菜葉片和塊根中的表達量均顯著增強(圖4)。

WT.野生型;AVP1.轉基因植株;不同小寫字母代表處理間差異顯著(P<0.05)。下同。圖3 不同磷濃度對轉基因甜菜AVP1基因表達的影響WT. Wild type; AVP1. Transgenic plants; Different normal letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level (P<0.05). The same below.Fig.3 The effect of different P concentrations on the gene expression of wild and transgenic types

圖4 干旱(A)和高鹽(B)脅迫下甜菜不同器官AVP1基因表達Fig.4 AVP1 gene expression level under drought stress (A) or salt stress (B)

2.2 轉AVP1基因提高甜菜磷素吸收能力的影響

如圖5,A顯示了在不同磷供給處理下的土壤磷含量,結果顯示培養轉AVP1基因甜菜的土壤磷含量均低于種植WT甜菜的土壤,且差異顯著(P<0.05)。在相同的磷含量供應和相同的處理方法下,轉基因甜菜含磷量均高于野生型甜菜,其中在CK條件下,前者比后者高出65%,可見轉基因甜菜比野生型具有更高的磷吸收能力。

圖5 不同磷濃度對土壤和轉基因甜菜植株含磷量的影響Fig.5 The phosphorus content of soil and plants under different P concentrations

植株葉片內磷濃度取決于土壤磷供應水平,低磷條件(P1)下,雖轉基因甜菜和野生型甜菜的磷含量與CK條件相比均顯著降低,但轉AVP1植株仍顯著高于WT植株。轉基因甜菜的含磷量隨著磷供給的增加而增加趨勢明顯,而野生型植株在高磷條件(P3)下磷含量與CK條件無明顯差異,可見轉基因甜菜與野生型植株相比具有充分利用過量磷的吸收能力。

2.3 轉AVP1基因甜菜抗旱性

野生型植株在正常生長條件與轉基因植株在生長形態上基本一致,沒有明顯差別(圖6,A)。但隨著干旱脅迫的持續,野生型植株的生長在處理第5天時首先出現萎蔫現象,生長受到抑制,而同時轉基因植株仍然正常生長,直到第7天才發生萎薦(圖6,B),而此時野生型植株表現受害程度更重;干旱處理第8天對所有植株做復水處理,2 d后,轉基因植株解除萎蔫并基本恢復正常生長,而野生型植株則發生永久萎薦,最后死亡(圖6,C)?？梢?AVP1基因的超表達提高了轉基因甜菜的抗旱性。

A.干旱脅迫前; B.干旱脅迫7 d; C.恢復灌水2 d。圖6 干旱脅迫對轉基因植株與野生型植株形態變化的影響A. Before drought stress; B. 7 days after drought stress;C. 2 days after resuming irrigation.Fig.6 The effect of drought stress on the morphological changes of transgenic type and wild

2.4 轉AVP1基因甜菜耐鹽性

選取植株生長形態基本一致的轉基因和野生型植株(圖7,A)用200 mmol/L NaCl處理,1周后二者的葉片均表現部分變黃,生長速度明顯緩慢,但野生型植株表現相對較嚴重的失綠現象。鹽脅迫處理期間,轉AVP1基因材料的長勢表現相對強于WT植株,總體受抑程度輕于野生型植株(圖7,B)。植株生物量測定結果顯示,在200 mmol/L NaCl處理14 d后,無論是地上部還是地下部,轉基因植株的生物量均顯著高于野生型植株,如轉基因植株的地上部鮮重是野生型植株的1.4倍(圖8)?？梢?AVP1轉基因植株具有比野生型植株更強的耐鹽性。

A.鹽脅迫處理前; B.鹽脅迫處理28 d后。圖7 鹽脅迫對野生型植株與轉基因植株形態的影響A. Before salt stress; B. 28 days after salt stress.Fig.7 The morphological changes of transgenic type and wild type under salt stress

*表示材料間在0.05水平差異顯著。圖8 200 mmol/L NaCl處理植株生物量* represents significant difference between materials at 0.05 level.Fig.8 Biomass of plants treated with 200 mmol/L NaCl

2.5 轉AVP1基因植株中細胞膜穩定性和滲透能力

植物器官在逆境傷害下往往發生膜脂過氧化作用,丙二醛(MDA)是細胞膜脂質過氧化作用的產物之一,其含量一定程度上可以反映遭受逆境傷害的程度[9]。

本研究中,WT植株與轉AVP1基因植株葉片中MDA含量在脅迫處理前沒有差異(圖9),但隨著NaCl濃度的增加或干旱脅迫的加劇,二者植株葉片MDA含量均呈增加趨勢,但轉基因甜菜表現較為緩慢的增加趨勢,在鹽處理14 d或干旱脅迫5 d后,二者的MDA含量開始表現明顯差異,鹽處理繼續到21,28 d時,WT植株的MDA含量比轉AVP1植株分別高出24.5%和26.7%;而在干旱處理5 d、7 d后,則分別高出15.6%和22.1%,由以上結果可見轉AVP1基因植株具有較高細胞膜穩定性,因而比野生型植株表現較高抗鹽和抗旱性。

圖9 鹽脅迫(A)和干旱條件(B)下甜菜植株葉片丙二醛含量Fig.9 MDA content in leaves of sugar beet plants under salt (A) and drought (B) stress

由圖10可知,在逆境條件下,植物體內具有較強水合能力的游離脯氨酸含量會顯著增加,其通過穩定原生質膠體及組織內的代謝過程來提高植物的抗逆性。本試驗中,轉AVP1基因甜菜植株和WT植株在鹽脅迫和干旱處理條件下,游離脯氨酸含量均高于處理前,但增加幅度表現為轉AVP1基因甜菜植株大于WT植株。

圖10 干旱(A)、鹽脅迫(B)條件下甜菜植株葉片脯氨酸含量Fig.10 Proline content in leaves of sugarbeet plants under drought (A) and salt (B) stress

鹽脅迫28 d和干旱脅迫7 d后,前者游離脯氨酸含量比后者分別高出27.1%和30.3%,均達到顯著差異(P<0.05)。表明轉基因甜菜比野生型植株具有較強滲透調節能力,從而可緩解高鹽或干旱條件對植株造成的滲透脅迫,一定程度上緩解其造成的傷害。

3 討 論

由于外源基因遺傳具有不穩定性,在轉基因植株體內表達水平相對較低,甚至靶基因丟失的現象時有發生[10]。此外,研究發現,在相同的條件下,用同樣的轉化方法轉化同一種外源基因,所獲得的轉基因植株間不僅外源基因表達水平差異很大,而且由于轉基因的間接作用還可能使轉基因植物出現額外的表型變異[11],這可能是由于DNA插入位點不同而造成的,從而在一定程度上限制了轉基因植物的商品化進程[9]。本研究中采用qRT-PCR方法檢測AVP1基因在甜菜中的表達特性,結果表明目的基因在甜菜繼代培養植株中穩定存在,在轉基因甜菜中正常表達,但在根和葉中的表達強度不同。在溫室盆栽培養條件下,轉AVP1基因甜菜與野生型植株生長表現無差異,說明該外源靶基因的插入并未對其生長發育產生不利影響。

甜菜對磷需求量大,但甜菜的主要產區的北方地區土壤普遍磷供應不足,因有效磷濃度低、磷肥利用率低等條件對甜菜生產造成一定的限制。土壤中磷素容易被固定,因此植物根系發育程度對磷的吸收起重要作用[12]。研究表明H+-焦磷酸酶編碼基因的過表達可促進多種植物根系的生長和發育[4-5]。本研究比較了轉AVP1基因甜菜和野生型甜菜的低磷耐受性,研究結果表明利用生物技術手段在甜菜中過表達AVP1基因提高甜菜對磷的吸收,從而提高低磷條件下甜菜的產質量是可選擇的有效途徑。

干旱、高鹽等是限制植物生長的主要非生物脅迫因素,利用生物技術手段將與耐鹽抗旱特性相關的外源基因引入植物中,進而選育耐鹽抗旱新品種一直是植物抗逆研究的研究熱點[13]。不同非生物逆境條件可對植物細胞膜造成氧化傷害及引起滲透脅迫,進而影響相關生理代謝過程[14]。本研究中通過分析轉AVP1基因甜菜在干旱脅迫和鹽脅迫下的生理生化指標表明,在相關逆境脅迫下MDA含量均有所增加,但與野生型植株相比,轉基因材料具有較低MDA含量和較高游離脯氨酸含量。可見外源基因AVP1的表達一定程度上保護了細胞的膜系統,同時轉基因甜菜可通過自身積累游離脯氨酸參與滲透調節,緩解相關逆境條件造成的滲透脅迫,增強轉化植株對相關逆境脅迫的耐受性,從而可以更好地適應干旱或鹽脅迫環境。

本研究以AVP1基因轉化甜菜,結果顯示AVP1基因可在甜菜地上、地下部表達,且逆境脅迫條件下表達量增強,轉AVP1基因甜菜具有比野生型甜菜更高的磷素吸收利用效率;干旱、鹽脅迫處理條件下,AVP1基因在轉基因甜菜中顯著上升,與野生型植株相比,轉基因植株體內MDA含量較低而脯氨酸含量顯著增加,AVP1基因可減輕逆境對甜菜細胞膜損傷,提高甜菜細胞滲透調節能力,由此可見AVP1基因過量表達一定程度上提高了轉基因甜菜的磷素吸收能力和耐鹽性、抗旱性,這對培育甜菜新品系創制了新的育種材料。隨著對H+-PPase功能的逐漸了解,以及對植物抗逆分子機制的研究和生物技術不斷完善,有望為培育高效、耐鹽、抗旱同時具有高效磷吸收能力的甜菜新品種開辟新的途徑。