CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的棉花GhNAC3基因編輯

王志軍,何宗鈴,張國(guó)麗,焦灰敏,桑玉偉,馬盼盼*

(1 新疆農(nóng)墾科學(xué)院 生物技術(shù)研究所/作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832000;2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,新疆阿拉爾 843300)

棉花是中國(guó)最重要的纖維作物和重要的油料作物,新疆是中國(guó)最大的產(chǎn)棉區(qū),然而,新疆棉花生產(chǎn)頻繁受到干旱脅迫,對(duì)棉花安全生產(chǎn)造成較大不利影響。篩選棉花抗旱品種或者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高棉花的抗旱能力成為有效的應(yīng)對(duì)措施。目前,已有一些棉花抗旱相關(guān)基因的功能被報(bào)道,其中NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是植物所特有,其不僅參與植物在生長(zhǎng)發(fā)育方面的調(diào)節(jié),在調(diào)控植物響應(yīng)不同逆境脅迫方面也發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。在植物中過(guò)表達(dá)NAC轉(zhuǎn)錄因子,可以增強(qiáng)植株對(duì)逆境的抗性,并且有些可以增強(qiáng)對(duì)多種脅迫的抗性[1]。目前,NAC轉(zhuǎn)錄因子在幾十種植物中被發(fā)現(xiàn),并對(duì)該家族基因的時(shí)空及誘導(dǎo)表達(dá)特性、結(jié)構(gòu)及功能等方面的研究取得了較快的進(jìn)展。在不同物種中均有報(bào)道,說(shuō)明NAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物抗旱性的調(diào)節(jié)。煙草NAC轉(zhuǎn)錄因子NtNAC053能增強(qiáng)煙草在干旱脅迫下的存活率[2]。番茄中過(guò)表達(dá)NAC家族轉(zhuǎn)錄因子SlNAP1顯著提升番茄的抗旱性[3]。小麥抗旱基因TaNAC071-A可提高小麥在干旱脅迫下水分利用效率、存活率[4]。水稻中轉(zhuǎn)錄因子OsNAC2d正調(diào)控水稻響應(yīng)干旱脅迫[5-6]。胡美玲[7]研究表明,棉花中GhNAC3受PEG和NaCl誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá),另外,對(duì)GhNAC3啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn),該基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有響應(yīng)干旱、鹽和ABA的一些順式作用元件。無(wú)論在擬南芥還是在棉花中該基因的超量表達(dá)都會(huì)提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱脅迫的抗性[7]。探究GhNAC3對(duì)于棉花響應(yīng)干旱脅迫的作用,對(duì)棉花抗旱分子育種具有重要的意義。

基因組定向編輯技術(shù)對(duì)特定靶基因進(jìn)行精確修飾,在作物基因功能研究和品種改良過(guò)程中具有廣闊的應(yīng)用潛力。CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù),具有操作簡(jiǎn)便、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)只需表達(dá)Cas9核酸酶和1個(gè)經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的單導(dǎo)向RNA(sgRNA),就可以完成對(duì)基因組特定位點(diǎn)的切割,其序列特異性通過(guò)改變sgRNA中20個(gè)核苷酸的引導(dǎo)序列而實(shí)現(xiàn)[8],目前,CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)用來(lái)在多種植物中定向突變目標(biāo)基因,比如有研究利用該系統(tǒng)敲除了水稻的OsPDS基因,獲得了水稻白化體突變植株[9]。

目前,雖然對(duì)NAC轉(zhuǎn)錄因子功能進(jìn)行了廣泛研究,但是NAC轉(zhuǎn)錄因子耐旱性相關(guān)的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究,在棉花上取得的研究進(jìn)展還較為有限。棉花中NAC轉(zhuǎn)錄因子如何參與棉花抵御非生物逆境的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究,因此,本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向突變棉花的GhNAC3基因,獲得了目標(biāo)基因序列堿基發(fā)生缺失的轉(zhuǎn)基因植株,并獲得了植株同時(shí)黃化和矮化的突變體,這些研究結(jié)果可以充分證明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向突變棉花的基因,是研究基因功能的有效手段;另一方面,篩選鑒定抗旱相關(guān)的基因資源,對(duì)培育干旱耐受型棉花品種具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

CRISPR/Cas9植物基因敲除用到的載體有pRGEB32-7和pGTR4(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)金雙俠課題組饋贈(zèng)),大腸桿菌菌株為T(mén)1,農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404,均為本實(shí)驗(yàn)室保存。主要酶及試劑:Ex-Taq酶(Takara公司),瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(南京諾唯贊公司)、植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根)、Bsa Ⅰ(New England Biolabs公司)、Exnase Ⅱ(南京諾唯贊公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

根據(jù)棉花GhNAC3(Gh_D02G0790)序列特征,利用CRISPR-GE在線軟件http://skl.scau.edu.cn/home/在第一外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)編輯靶點(diǎn)(圖1),并將2個(gè)靶點(diǎn)序列在棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì),以消除非特異性靶點(diǎn)干擾。

圖1 GhNAC3的2個(gè)gRNA靶點(diǎn)位置Fig.1 Position of two gRNA targets in the GhNAC3 gene locus

1.2.1 小片段擴(kuò)增和連接

設(shè)計(jì)好的引物由公司合成(上海生物工程股份有限公司),純化級(jí)別為PAGE。gRNA+tRNA組合序列已經(jīng)插入pGTR4載體,第1次PCR:1、2兩片段分別從含有pGTR4載體的質(zhì)粒中擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為20 μL體系,反應(yīng)條件:95 ℃,4 min;95 ℃,30 s;55 ℃,30 s;72 ℃,20 s,3個(gè)循環(huán);95 ℃,30 s;60 ℃,30 s;72 ℃,20 s,27個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。第2次PCR使用重疊延伸PCR,使2個(gè)獨(dú)立的PCR產(chǎn)物借助接頭經(jīng) Taq 酶延伸成為融合片段,將2個(gè)小片段進(jìn)行拼接,電泳檢測(cè),并用試劑盒進(jìn)行回收、純化,所用引物見(jiàn)表1。

表1 所用的引物序列

1.2.2 載體酶切與連接

提取含pRGEB32-7載體的質(zhì)粒,測(cè)定濃度,使用限制性核酸內(nèi)切酶BsaⅠ進(jìn)行單酶切。100 μL酶切體系中,其中pRGEB32-7載體10 μg(根據(jù)濃度計(jì)算體積),10× cut smart Buffer 10 μL,BsaⅠ酶4 μL,ddH2O補(bǔ)足至100 μL。37 ℃酶切6 h,可以適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間,使反應(yīng)更充分。連接載體使用南京諾唯贊的非連接酶依賴(lài)型單片段快速克隆試劑盒(ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit),連接方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū),其中目的片段100 ng,線性化表達(dá)載體100 ng,Exnase Ⅱ酶1 μL,CEBuffer 2 μL。37 ℃水浴30 min,冰浴5 min。連接產(chǎn)物可以-20 ℃長(zhǎng)期保存。

1.2.3 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

(1)取2 μL構(gòu)建成功的pRGEB32-GhNAC3重組質(zhì)粒加入100 μL冰浴的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞(LBA4404),輕輕混勻,放入電擊杯中,電壓設(shè)置為1 800 V,電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌;(2)將電轉(zhuǎn)值大于5的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒迅速加入500 μL LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素),28 ℃培養(yǎng)3 h,5 000 r/min離心5 min,去除上清500 μL,剩余菌體懸浮,涂布于含1/1000抗生素(Kan和Rif)的LB固體培養(yǎng)基中,28 ℃倒置培養(yǎng)48 h;(3)挑取單克隆菌株,含1/1000抗生素(Kan和Rif)的LB液體培養(yǎng)基,220 r/min培養(yǎng)16～24 h,PCR鑒定為陽(yáng)性菌株。

1.2.4 pRGEB32-GhNAC3棉花遺傳轉(zhuǎn)化

含pRGEB32-GhNAC3的基因編輯載體的LBA4404農(nóng)桿菌浸染陸地棉YZ-1的下胚軸,具體操作步驟參照朱守鴻[10]方法并稍作改良。

1.2.5 基因編輯株系的靶點(diǎn)分析與鑒定

為檢測(cè)GhNAC3的靶點(diǎn)突變情況,在2個(gè)靶點(diǎn)序列兩側(cè)分別設(shè)計(jì)引物GhNAC3-F/GhNAC3-R,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為507 bp,通過(guò)植物DNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因植株葉片的DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè),擴(kuò)增片段回收純化連接T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)T1,在含1/1000抗生素(kan)的LB培養(yǎng)基搖菌,提取質(zhì)粒,寄送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果與野生型DNA的擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析,鑒定突變植株的基因變異類(lèi)型。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhNAC3靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和CRISPR-GhNAC3載體構(gòu)建

利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)cotton FGD(https://cottonfgd.net/)下載GhNAC3(Gh_D02G0790)的全長(zhǎng)序列,CDS序列和氨基酸序列,GhNAC3位于棉花D02染色體,DNA序列編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 241 bp,由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成,將上游靠近啟動(dòng)子區(qū)域第一外顯子作為突變區(qū)域設(shè)計(jì)靶點(diǎn),利用靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)軟件CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/home/)[11]在線設(shè)計(jì),并將2個(gè)靶點(diǎn)序列在棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì),以消除非特異性靶點(diǎn)干擾。選取第一外顯子的正義鏈+25 bp到+27 bp處的CGG為PAM(protospacer-adjacent motif)序列,+5 bp到+24 bp之間的20 bp堿基作為靶點(diǎn)1序列,第一外顯子的反義鏈+117 bp到+119 bp處的GGG堿基為PAM序列,+120 bp到+140 bp區(qū)間的20 bp堿基作為靶點(diǎn)2的編輯序列(圖1)。

GhNAC3的氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析表明,GhNAC3氨基酸序列具備典型的NAM結(jié)構(gòu)域,在氨基酸序列11～134之間,具有典型的NAC類(lèi)蛋白的結(jié)構(gòu)特征,共包含1個(gè)結(jié)構(gòu)域,編輯靶點(diǎn)2位于該結(jié)構(gòu)域。

2.2 GhNAC3基因遺傳轉(zhuǎn)化

為使重組CRISPR/Cas9載體中的2個(gè)靶點(diǎn)序列由AtU6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng),通過(guò)酶切、連接將雙鏈靶點(diǎn)序列與AtU6-sgRNA載體連接,將回收純化的Atu6-sgRNA片段與BsaⅠ酶切線性化的CRISPR-Cas9(pRGEB32-7)載體連接(圖2),通過(guò)T4 DNA連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞T1,在含Kan(50 mg/mL)抗性的LB平板上挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切驗(yàn)證,經(jīng)測(cè)序分析表明,重組載體中的2個(gè)靶點(diǎn)序列(圖3)與設(shè)計(jì)序列一致(表1),說(shuō)明靶點(diǎn)準(zhǔn)確連接到CRISPR/Cas9載體上,鑒定正確的重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)(LB4404)。參照朱守鴻[10]的棉花遺傳轉(zhuǎn)化方法,轉(zhuǎn)化受體材料YZ-1。

LB.左邊界;RB.右邊界。圖2 2個(gè)靶位點(diǎn)sgRNA表達(dá)盒與CRISPR/Cas9組裝成的表達(dá)載體LB. Left border; RB. Right border.Fig.2 Cloning of two sgRNA cassettes into the CRISPR/Cas9 vector

圖3 CRISPR-GhNAC3 重組載體中2個(gè)靶點(diǎn)序列測(cè)序結(jié)果Fig.3 Sequencing results for the two target sequences inserted in CRISPR-GhNAC3 recombinant vector

無(wú)菌苗的獲得,種子去殼后,用0.1%的升汞消毒15 min,用無(wú)菌水清洗6次;將消毒后的種子接種于無(wú)菌苗培養(yǎng)基M0(1/2 MS 培養(yǎng)基+15 g/L葡萄糖+6.5 g/L瓊脂粉),28 ℃暗培養(yǎng)5～7 d備用;愈傷組織的誘導(dǎo),無(wú)菌條件下,將暗培養(yǎng)5～7 d的YZ-1幼苗,使用無(wú)菌手術(shù)刀切除根部和子葉,將下胚軸切成0.5～0.8 cm的小段備用;用OD值為0.8左右的pRGEB32-GhNAC3農(nóng)桿菌菌液(含50 mg/mL乙酰丁香酮)侵染下胚軸15 min;去除多余菌液,迅速將下胚軸倒入無(wú)菌濾紙上,鋪平,用濾紙將下胚軸表面的菌液吸干,20 ℃,共培養(yǎng)基暗培養(yǎng)48 h,28 ℃選擇培養(yǎng)基含1/1000抗生素(Cef和kan)光照培養(yǎng),25～30 d繼代1次;選擇培養(yǎng)70 d左右,將下胚軸(褐化嚴(yán)重的去除)移至含1/1000抗生素(Cef和kan),2,4-D減半愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,25 d左右繼代1次,直至出現(xiàn)顆粒狀的胚性愈傷;選擇胚性愈傷繼代于分化培養(yǎng)基上,20 d 左右繼代1次,及時(shí)淘汰未分化愈傷組織,直至出現(xiàn)黃綠色顆粒的球形胚;挑取球形胚繼續(xù)在分化培養(yǎng)基誘導(dǎo),直至子葉胚的出現(xiàn);將萌發(fā)出幼根和幼葉的子葉胚移至生根培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng),直至成苗。

獲得組培再生棉苗,再生苗水培煉苗后直接移栽到營(yíng)養(yǎng)土中,獲得生長(zhǎng)發(fā)育良好的轉(zhuǎn)基因再生植株(T0),組織培養(yǎng)再生苗過(guò)程見(jiàn)圖4,第2年將編號(hào)為5的T0代種子播種于大田,獲得了同時(shí)黃化和矮化的突變體3株(圖4)。根據(jù)Cas9 DNA序列,設(shè)計(jì)特異性引物,擴(kuò)增目的片段大小為512 bp,提取組培獲得的正常再生植株的DNA,對(duì)Cas9蛋白檢測(cè)為陽(yáng)性株的進(jìn)行靶位點(diǎn)區(qū)域測(cè)序。結(jié)果表明,CRISPR-GhNAC3的再生植株中,有16株檢測(cè)到Cas9蛋白基因,表明CRISPR-GhNAC3載體被成功轉(zhuǎn)入YZ-1受體,靶位點(diǎn)可能被成功編輯(圖5)。

圖4 CRISPR-GhNAC3遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程Fig.4 Process of genetic transformation of CRISPR-GhNAC3

圖5 GhNAC3棉花株系PCR驗(yàn)證Fig.5 The PCR validation of CRISPR-GhNAC3 cotton lines

2.3 基因編輯類(lèi)型檢測(cè)

為了進(jìn)一步確定GhNAC3基因的靶標(biāo)位點(diǎn)是否產(chǎn)生突變,對(duì)PCR檢測(cè)到Cas9蛋白基因的5、6、7、8、9、10的T0代植株的目標(biāo)基因靶點(diǎn)及其上、下游序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析(圖5和圖6)。以T0代GhNAC3突變體棉花DNA為模板的PCR反應(yīng)中,擴(kuò)增片段大小為507 bp,對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析表明,共有6株陽(yáng)性株靶點(diǎn)序列發(fā)生缺失突變,其中7,8,9株在2個(gè)靶點(diǎn)區(qū)域均發(fā)生堿基片段缺失,靶點(diǎn)1缺失片段大小為23～28 bp不等,靶點(diǎn)2缺失片段大小為3 bp,以上結(jié)果表明靶點(diǎn)的缺失會(huì)導(dǎo)致氨基酸序列移碼變異,從而產(chǎn)生表型變異突變體。編號(hào)為5的T1代植株,其在靶點(diǎn)1區(qū)域出現(xiàn)大小為26 bp的片段缺失,田間出現(xiàn)同時(shí)黃化和矮化的表型突變,共3株,也可以驗(yàn)證上述結(jié)論。

紅色字母為靶點(diǎn)序列,藍(lán)色大寫(xiě)字母表示PAM序列,刪除線表示缺失堿基,-.缺失,WT.野生型。圖6 轉(zhuǎn)化植株編輯靶點(diǎn)的PCR產(chǎn)物測(cè)序序列與野生型(WT)序列的比對(duì)結(jié)果The red letters are the target genome sequence; The blue capital letters denote PAM;Dashes strike through indicate the deleted bases; -. Deletion; WT. Wild type.Fig.6 Sequence alignment of the edited targets for the GhNAC3 mutants and WT line

3 討 論

新疆是中國(guó)主要植棉區(qū),2022年新疆棉花產(chǎn)量539.1萬(wàn)t,較上年增加26.2萬(wàn)t,占全國(guó)棉花總產(chǎn)量的比重持續(xù)提升,達(dá)到90.2%,創(chuàng)歷史新高,新疆棉花總產(chǎn)、單產(chǎn)、種植面積、商品調(diào)撥量連續(xù)28年位居全國(guó)第一(國(guó)家統(tǒng)計(jì)局)。但是,近年來(lái)新疆棉花種植業(yè)的發(fā)展越來(lái)越受到資源環(huán)境約束,最重要的一點(diǎn)就是水資源不足[12],干旱已經(jīng)成為新疆棉花產(chǎn)業(yè)安全的最大威脅。干旱可以嚴(yán)重制約農(nóng)作物的生長(zhǎng),導(dǎo)致產(chǎn)量降低,同時(shí)在干旱脅迫下,植物的生長(zhǎng)、發(fā)育乃至光合與呼吸作用都會(huì)受到不良影響,甚至?xí)淖冎参锶~片大小,影響植物莖桿延伸和根的增殖,擾亂植物體內(nèi)水分平衡[13]。因此,提高作物抗旱能力可以直接影響產(chǎn)量。傳統(tǒng)育種有著操作復(fù)雜,育種周期長(zhǎng),利用生物技術(shù)手段研究農(nóng)作物在干旱脅迫條件下的分子機(jī)制,創(chuàng)造新的耐旱品種成為了農(nóng)作物抗逆品種改良的研究熱點(diǎn)[14]。

目前,克隆的抗旱基因已有較多報(bào)道,其中NAC轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物響應(yīng)逆境脅迫方面也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在植物中過(guò)表達(dá)NAC基因發(fā)現(xiàn),部分該家族基因可以增強(qiáng)植株對(duì)逆境的抗性,并且有些可以增強(qiáng)對(duì)多種脅迫的抗性[1]。超量表達(dá)擬南芥NAC家族基因ANAC019、ANAC055和ANAC072,超表達(dá)植株耐旱性得到改善,同時(shí)發(fā)現(xiàn)多個(gè)與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因被誘導(dǎo)表達(dá)[15]。在水稻中超表達(dá)SNACl能夠顯著增強(qiáng)水稻對(duì)干旱脅迫的忍耐能力,正常生長(zhǎng)環(huán)境下,轉(zhuǎn)基因水稻表型無(wú)明顯差異。但是,在生殖生長(zhǎng)期進(jìn)行嚴(yán)重的干旱處理,發(fā)現(xiàn),超量表達(dá)SNACl的水稻材料坐果率高于對(duì)照22%～34%,轉(zhuǎn)基因水稻也可以顯著增強(qiáng)在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的干旱脅迫[16]。超表達(dá)大麥中SNACl同源基因HvSIVACl可以增強(qiáng)植株抵御干旱脅迫能力,表現(xiàn)為改善葉片光合活性,減少葉片的水分蒸騰作用,并增加生物產(chǎn)量[17]。康振生院士團(tuán)隊(duì)通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析方法,克隆了1個(gè)小麥抗旱基因TaNAC071-A,過(guò)表達(dá)該基因則能夠顯著增強(qiáng)小麥抗旱性[18]。水稻中過(guò)表達(dá)OsNAC14基因可提高水稻耐旱性[19]。水稻中的OsNAC2通過(guò)ABA介導(dǎo)的通路在水稻干旱和耐鹽性中起正向調(diào)控作用,OsNAC05則負(fù)責(zé)根徑增大和抗旱性;同時(shí),OsNAC6也可增強(qiáng)水稻抗旱性[20]。一些NAC轉(zhuǎn)錄因子則通過(guò)調(diào)控脅迫相關(guān)基因應(yīng)對(duì)脅迫,過(guò)表達(dá)OsNAC1的轉(zhuǎn)基因植株,通過(guò)調(diào)控許多脅迫相關(guān)基因,如OsSRO1c和OsPP18,顯著提高了水稻對(duì)干旱和鹽的耐受性[21]。

番薯(Ipomoeabatatas)中ItbNAC62啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了ABA和茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)響應(yīng)的順式作用元件(cis-acting elements,CAEs),表明該基因通過(guò)ABA或MeJA信號(hào)通路參與了抗旱性[22]。在辣椒(Capsicumannuum)中,CaNAC46可通過(guò)上調(diào)LBD18和IAA4的表達(dá)來(lái)促進(jìn)側(cè)根的形成和根的伸長(zhǎng),從而增強(qiáng)其對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性,是正調(diào)控因子[23]。在云杉(Piceawilsonii)中,過(guò)表達(dá)PwNAC11顯著提高了ROS的清除能力,并有助于保護(hù)干旱脅迫下的過(guò)氧化損傷,同時(shí)PwNAC11作為一種ABA信號(hào)因子,通過(guò)促進(jìn)氣孔的關(guān)閉和ABA的合成,直接或間接地提高了植物對(duì)干旱脅迫的耐受性[24]。一些NAC轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控ROS含量和ABA合成來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫。在小麥中,TaNAC69的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了小麥的脫水耐受性[25]。此外,其他作物中也有關(guān)于NAC基因響應(yīng)干旱脅迫的報(bào)道,如鷹嘴豆、棉花、玫瑰等[26]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有方便、高效、周期短以及載體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。高效定向的CRISPR/Cas9系統(tǒng)能使受體材料的目的基因產(chǎn)生突變,達(dá)到目的基因的編輯效果,被廣泛應(yīng)用于各種作物中,比如水稻[27]、玉米[28]和煙草[29]等。王加峰等[30]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)調(diào)控水稻產(chǎn)量千粒重的基因TGW6定點(diǎn)編輯,T0代該基因突變頻率約為90%,其中純合缺失突變率高達(dá)51%,T1代純合缺失突變體千粒重顯著增加。中國(guó)水稻研究所[31]采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)控制水稻香味的BADH2基因進(jìn)行敲除,結(jié)果表明突變體材料中香味物質(zhì)顯著增加。Li等[32]利用CRISPR/Cas9技術(shù)以非同源重組的末端(NHEJ)修復(fù)方式對(duì)水稻5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因EPSPS進(jìn)行編輯,實(shí)現(xiàn)了EPSPS基因保守區(qū)域2個(gè)重要氨基酸的定點(diǎn)置換,在T0代獲得具有草甘膦抗性的突變體材料。Wang等[33]利用CRISPR/Cas9技術(shù)修飾稻瘟病侵染效應(yīng)因子基因(OSERF922),以提高水稻對(duì)稻瘟病的抗性。Tang等與袁隆平團(tuán)隊(duì)[34]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除水稻中與鎘離子吸收和積累相關(guān)的基因,獲得了抗鎘毒害的水稻品種。杜邦先鋒公司利用CRISPR/Cas9技術(shù),將糯玉米性狀直接引入具有優(yōu)良性狀的雜交種中,解決了糯玉米產(chǎn)量低的問(wèn)題,同年,該公司利用CRISPR/Cas9技術(shù)將1個(gè)玉米內(nèi)源啟動(dòng)子GOS2精確插入到玉米中乙烯應(yīng)答調(diào)控因子ARGOS8的5′端,獲得耐旱材料[35]。本研究以棉花抗旱基因GhNAC3基因?yàn)閷?duì)象進(jìn)行研究,構(gòu)建了2個(gè)單靶點(diǎn)CRISPR/Cas9重組載體,采用U6啟動(dòng)子啟動(dòng)sgRNA,35S啟動(dòng)子高效表達(dá)Cas9蛋白,最終達(dá)到成功編輯GhNAC3基因的目的。