低溫誘導表達SlBRI1增強番茄幼苗耐寒能力

楊文文,馮夢穎,瞿 芮,劉心雨,聶書明

(西華師范大學 生命科學學院,西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室,四川南充 637000)

番茄(SolanumlycopersicumL.)屬于茄科(Solanaceae)番茄屬(LycopersiconMiller)的喜溫性草本植物,是開展生物學基礎研究的一個重要對象,同時也是一種模式植物[1]。干旱[2]、弱光[3]、低溫[4]等非生物脅迫是影響植物生長發育的重要因素。由于部分地區氣候條件惡劣,番茄極易遭受低溫冷害。低溫脅迫會導致植物出現光合作用減弱、抗氧化酶活性降低、活性氧含量增加、葉綠素降解、生長發育受阻等生理現象,造成植株生長遲緩、幼苗萎蔫、坐果率低等情況,最終影響番茄的產量和品質[4]。光合作用對溫度十分敏感,通過將光能轉化為穩定的化學能為植物生長發育提供能量,是影響作物產量的關鍵要素之一[5]。研究發現低溫會破壞葉綠體亞顯微結構,并發生光抑制,致使葉綠體內光能剩余過多,活性氧產率增加,進而造成光合作用下降[6]。在自然光照條件下,葉綠素熒光參數和光合速率兩者之間存在負相關關系,通過葉綠素熒光參數可以評估植物對過剩光能的消散能力[7]。因此,植物受脅迫程度可通過植物光合作用和葉綠素熒光特性評估[8]。

油菜素內酯(brassinosteroids,BRs)參與調節植物的生長、發育以及脅迫響應等多個生理過程[9],對作物的產量、品質、抗逆性和抗病性等方面有著重要的調控作用[10]。目前外源施加天然BRs已被用于提高多種植物抵抗低溫能力[11-12]。BR在信號轉導過程中首先與BRI1(brassinosteroid insensitive 1)結合,促進其依次轉磷酸化,并與其共受體BAK1(BRI1-ASSOCIATED KINASE 1)結合形成異源二聚體,BRI1與BAK1相互作用并激活BR信號,隨后BR信號被轉導到下游元件。去磷酸化的BES1(bri1-EMS suppressor 1)和BZR1(brassinazole resistance 1)在細胞核中積累,調控幾千個BR響應基因的表達[2]。研究發現過表達BR合成基因DWARF可提高番茄幼苗BR含量和抗寒性,與之相反突變體降低了BR含量,降低了植物的抗寒性[12]。BR信號基因BIN2(brassinosteroids-insensitive 2)是BR信號的負調控因子,在植物對低溫脅迫的反應中起著關鍵作用。bin2突變體表現出更高的抗凍性,而BIN2過表達降低了番茄幼苗的抗凍性[4]。過表達SlBZR1通過提高ABA水平和CBF1的表達來提高轉基因植株的耐寒性,而bzr1突變體則降低番茄植株的耐寒性[13]。BRI1作為BR的主要信號受體,35S啟動子驅動過表達SlBRI1能有效清除ROS,緩解光抑制以及調控植物激素合成和信號傳導,提高了轉基因植物的抗寒性,而BRI1突變體bri1-1和bri1-301降低了植物的抗寒能力[14-16]。rd29A作為一種重要的逆境誘導型啟動子,能夠響應低溫、鹽脅迫、干旱等環境脅迫[17-18]。目前,rd29A已經被廣泛應用于緩解基因的負面影響[19]。rd29A啟動子驅動的AtDREB1A/CBF3,通過增強關鍵抗氧化酶的活性來緩解轉基因番茄干旱誘導的氧化應激[20]。由rd29A啟動子驅動的ICE1基因在正常條件下在轉基因水稻品系中正常表達,而低溫脅迫后轉基因品系ICE1基因表達增加,抗寒性提高[21]。在目前研究的低溫調控網絡中,ICE-CBF-COR信號途徑為報道較廣泛的通路之一[22]。ICE1是CBF3低溫響應中的關鍵基因,其通過磺酰化修飾被激活后,能夠與CBF3啟動子相結合,上調CBF3基因的表達,從而顯著提高植株低溫脅迫的應答[23]。

前人研究結果顯示,BR信號基因在植物響應冷脅迫過程中發揮重要作用,可以通過調節植物激素、增強抗氧化酶活性和抗寒基因的表達來提高植物的抗寒性[17]。但目前關于番茄Atrd29A啟動BR受體SlBRI1在響應冷脅迫過程中的調節規律尚不清楚。本研究以Atrd29A啟動的SlBRI1基因為切入點,番茄品種Micro-Tom(MT)、SlBRI1過表達株系(Atrd29A:SlBRI1)為材料,在低溫環境下對番茄幼苗的抗寒能力進行比較分析。通過相關指標闡明SlBRI1過表達對番茄抗冷性的生理調控效應,旨在揭示BR信號強度與番茄抗冷性兩者之間的關系,為今后選取耐寒性番茄品種提供理論依據,對農業生產也有一定的參考價值。

1 材料和方法

1.1 試驗設計

試驗于西華師范大學生命科學學院實驗室進行。實驗材料為番茄Micro-Tom (MT)種子和SlBRI1過表達T3代轉基因種子。SlBRI1過表達轉基因番茄植物參考Nie等人的方法獲得[24]。根據SlBRI1表達量選取2個獨立的純合SlBRI1過表達株系(Atrd29A:SlBRI1-2、Atrd29A:SlBRI1-5)進行低溫實驗。選取飽滿且大小一致的番茄種子,進行消毒、浸種,置于25 ℃培養箱中催芽處理,種子露白后播于營養缽內(泥炭∶MIKSKAAR=1∶1),幼苗生長在溫度為25 ℃,光周期為16 h/8 h的溫室中。當番茄苗長至五葉一心時,對MT、Atrd29A:SlBRI1-2和Atrd29A:SlBRI1-53組材料進行4 ℃低溫處理,試驗設3次重復。測定低溫脅迫后0 d、5 d的光合參數、熒光參數以及相關逆境基因轉錄水平,并對其幼苗的抗寒能力進行比較分析。

1.2 測量指標及方法

光合參數:利用LI-6400便攜式光合作用測量系統(LI-COR公司,美國)測定幼苗從上而下第3片完全展開葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。所有的測量均在CO2濃度為400 μmol/mol,葉片溫度25 ℃和1 200 μmol/(m2·s)光強下進行。

葉綠素熒光參數:將葉片暗處理30 min后,使用LI-6400便攜式光合作用儀測定葉綠素熒光參數值。測定初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、光下最小熒光(Fo′)、光下最大熒光(Fm′)及穩態熒光(Fs)。根據測定的葉綠素熒光參數計算光系統Ⅱ(PS Ⅱ)中的最大光化學效率值:Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm,實際光能轉化效率值:ΦPS Ⅱ=(Fm′-Fs)/Fm′,開放的PS Ⅱ反應中心最大的光能轉化效率值:Fv′/Fm′=(Fm′-Fo′)/Fm′,光化學猝滅系數值:Qp=(Fm′-Fs)/(Fm′-Fo′),測定3次。

基因轉錄水平分析:用天根試劑盒提取番茄葉片總RNA。質量合格的RNA采用Vazyme反轉錄試劑盒合成cDNA。在實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)上進行qRT-PCR反應。定量檢測體系為20 μL:10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix,8 μL cDNA模板,正/反向引物各0.4 μL,1.2 μL ddH2O。反應條件為95 ℃ 30 s; 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s,40 個循環。每個樣品 3 次重復,以番茄UBI3基因為內參,采用2-ΔΔCT方法[25]計算所有株系中抗逆基因的相對表達量(SlBRI1、SlICE1、SlCBF1、SlCBF3和SlDRCI7)。

1.3 數據處理

采用SPSS 19.0軟件對數據進行單項因素方差分析,用Duncan’s多重比較進行差異顯著性分析(P<0.05),數據用平均值±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 Atrd29A啟動子表達SlBRI1對番茄幼苗SlBRI1表達水平的影響

如圖1所示,低溫脅迫0 d時,野生型和轉基因植株中SlBRI1基因的相對表達量具有顯著性差異。與低溫處理0 d相比,低溫脅迫5 d提高了MT、Atrd29A:SlBRI1-2和Atrd29A:SlBRI1-5中SlBRI1基因的相對表達量,MT野生型提高了3.45倍,而轉基因株系Atrd29A:SlBRI1-2和Atrd29A:SlBRI1-5分別提高了7.06倍和7.17倍。說明Atrd29A啟動子在低溫環境下能夠增強SlBRI1的表達。

柱狀圖上不同小寫字母表示材料間差異顯著(P<0.05)。下同。圖1 野生型(MT)和Atrd29A:SlBRI1番茄幼苗在低溫脅迫下SlBRI1轉錄水平的相對變化Different lowercase letters indicate significant differences among materials (P<0.05). The same as below.Fig.1 Relative changes of transcription levels of SlBRI1 in tomato seedlings of wild type (MT) and Atrd29A:SlBRI1 under low temperature stress

2.2 Atrd29A啟動子表達SlBRI1對番茄幼苗外在形態的影響

如圖2所示,低溫脅迫0 d時, MT和Atrd29A:SlBRI1轉基因植株外在形態無明顯差異,低溫脅迫5 d后,所有植株均表現出不同程度的萎蔫現象。Atrd29A:SlBRI1-2、Atrd29A:SlBRI1-5出現輕微的萎蔫,而MT植株萎蔫程度更明顯。說明Atrd29A:SlBRI1轉基因植株比MT抗寒能力更強。在25 ℃條件下恢復3 d后,各株系萎蔫狀況均有緩解,但MT植株的萎蔫程度仍比Atrd29A:SlBRI1-2、Atrd29A:SlBRI1-5枯萎程度明顯。表明SlBRI1基因對植株低溫后的恢復能力也有一定的調節作用。

圖2 野生型(MT)和Atrd29A:SlBRI1番茄幼苗在低溫脅迫0 d、5 d和恢復3 d后的表型Fig.2 Phenotypes of tomato seedlings of wild type (MT) and Atrd29A:SlBRI1 after 0 and 5 days of low temperature stress and 3 days of recovery

2.3 Atrd29A啟動子表達SlBRI1對番茄幼苗氣體交換參數的影響

如圖3所示,低溫脅迫0 d時,Pn、Gs、Tr和Ci野生型和Atrd29A:SlBRI1轉基因植株沒有顯著性差異。與脅迫0 d相比,低溫脅迫5 d后番茄葉片的Pn、Gs和Tr顯著下降(圖3,A、B、D),Ci呈上升趨勢(圖3,C)。說明在低溫條件下,CO2向葉綠體的轉運受到了限制,造成光合作用原料供應減少,從而導致光合速率的下降。其中Pn分別降低69.61%、64.91%、63.70%;Gs分別降低49.50%、32.91%、36.52%;Tr分別降低66.41%、59.13%、57.79%;Ci分別升高75.57%、61.33%、63.69%。較SlBRI1轉基因植株而言MT受低溫影響更明顯,低溫脅迫5 d后Atrd29A:SIBRI1-2、Atrd29A:SlBRI1-5的Pn、Gs和Tr均顯著高于MT,Ci顯著低于MT。說明誘導SlBRI1的表達能減緩低溫脅迫對植株光合特性的影響。

圖3 低溫脅迫對番茄幼苗葉片氣體交換參數的影響Fig.3 Effect of low temperature stress on gas exchange parameters of tomato seedling leaves

2.4 Atrd29A啟動子表達SlBRI1對番茄幼苗葉綠素熒光參數的影響

如圖4所示,低溫脅迫0 d時,MT和Atrd29A:SlBRI1轉基因植株的Fv/Fm、ΦPSⅡ、Fv′/Fm′、qP沒有顯著性差異。低溫脅迫5 d后,Fv/Fm、ΦPSⅡ、Fv′/Fm′和qP均低于脅迫前,Fv/Fm分別降低43.88%、36.36%、36.68%;ΦPSⅡ分別降低74.46%、66.49%、65.74%;Fv′/Fm′分別降低64.73%、57.65%、57.04%;qP分別降低57.52%、53.37%、52.63%。說明在光合作用過程中,低溫可能導致PSⅡ平衡被打破,導致光抑制,進而影響光合電子供給,在一定程度上影響了光能向化學能的轉化。低溫脅迫5 d后,Atrd29A:SlBRI1-2、Atrd29A:SlBRI1-5的Fv/Fm、ΦPSⅡ、Fv′/Fm′和qP降低的程度明顯低于MT。說明誘導SlBRI1的表達能減緩低溫脅迫對植株熒光特性的影響。

圖4 低溫脅迫對番茄葉片熒光參數的影響Fig.4 Effect of low temperature stress on fluorescence parameters of tomato leaves

2.5 Atrd29A啟動子表達SlBRI1對番茄幼苗抗冷基因表達的影響

如圖5所示,低溫處理0 d時MT、Atrd29A:SlBRI1-2和Atrd29A:SlBRI1-5的SlCBF1、SlCBF3表達水平具有顯著差異。

與低溫處理0 d相比,低溫處理5 d提高了MT、Atrd29A:SlBRI1-2和Atrd29A:SlBRI1-5中SlICE1、SlCBF1、SlCBF3和SlDRCI7基因的相對表達量,SlICE1基因相對表達量分別增加23.33%、87.07%、723.73%;SlCBF1基因相對表達量分別增加340.71%、392.34%、283.47%;SlCBF3基因相對表達量分別增加73.05%、572.79%、458.21%;SlDRCI7基因相對表達量分別增加325.46%、532.20%、6 993.82%。低溫處理5 d后,Atrd29A:SIBRI1-2和Atrd29A:SlBRI1-5中SlICE1、SlCBF1、SlCBF3和SlDRCI7基因的相對表達量顯著高于MT。表明Atrd29A:SlBRI1轉基因植株增強了低溫逆境基因表達水平,對低溫脅迫的響應能力顯著提高。

3 討 論

光合作用是一種受溫度影響較大的生理過程,在較低的溫度下,由于氣孔導度的降低,導致了葉面氣孔的閉合,從而降低了CO2的供給,光合作用受到氣孔因素限制[26]。在重度脅迫下,植物的光合能力受到氣孔因素和非氣孔因素的雙重限制,且以非氣孔因素為主[27]。本研究發現,低溫脅迫下番茄幼苗的Pn、Gs和Tr都有較大幅度地下降,表明低溫脅迫對番茄幼苗氣孔有明顯的抑制作用。同時,植株的Ci顯著升高,說明在較低的溫度下,氣孔的阻滯將對CO2的吸收和氣體交換造成不良的影響,光合作用受阻,這與楊鴻基等的研究結果[28]相一致。本研究結果顯示,經過5 d的低溫脅迫后,Atrd29A:SlBRI1轉基因植株葉片的Pn、Gs和Tr下降幅度小于MT野生型,Ci增長幅度大于野生型,表明野生型葉片氣體交換參數對低溫脅迫的敏感性大于轉基因型,誘導SlBRI1的表達能夠緩解低溫脅迫對植株光合作用的破壞,提高植株的抗寒能力[29]。

葉綠素熒光參數包含了極其豐富的生理信息,是檢測作物生長發育和光合特性的有效手段[30]。Fv/Fm體現了植物PSⅡ光能轉換的最大潛能,它反映了PSⅡ的原初光能轉化效率,Fv/Fm下降表明植株受到光抑制[31]。PSⅡ是光化學反應中心,極易受低溫影響,主要表現在光能的吸收、轉換與電子傳遞等方面[32]。Fv′/Fm′是開放PSⅡ反應中心的激發能捕獲效率[33]。qP是PSⅡ光化學猝滅系數,體現在光化學傳輸中所占PSⅡ天線色素吸收的光能的份額,qP下降表明植物光合作用中的暗反應受到影響[7]。本研究結果表明,低溫顯著降低了番茄葉片的Fv/Fm、ΦPSⅡ、Fv′/Fm′和qP,這與在葡萄上的研究結果[34]一致。此類結果說明在光合作用中低溫脅迫會破壞PSⅡ,并發生光抑制,影響其碳代謝過程中的電子供應[32],也對番茄幼苗PSⅡ的光能轉換成化學能有一定程度的阻礙。本研究結果顯示,SlBRI1轉基因植株在低溫環境下Fv/Fm、ΦPS Ⅱ、Fv′/Fm′和qP都顯著高于野生型植株,說明誘導SlBRI1的表達有利于緩解低溫對葉綠素熒光參數的影響。

ICE1-CBF-COR途徑作為植物應對低溫脅迫的重要一環,在提高植物脅迫應答層面具有不可忽視的效用[29]。CBFs轉錄因子是低溫脅迫過程中的重要分子開關,在一定程度上調控大量與低溫相關的基因,ICE1是其重要的轉錄調控因子[35]。在響應低溫應答過程中,ICE1轉錄因子被激活,使其下游基因CBFs及COR被誘導表達,能夠提高自身抵御低溫脅迫的能力[36]。植株通過過表達SlCBF2、SlCBF3和SlCBF1提高植物的耐寒性,相關研究表明,低溫能有效地誘導CBF1的表達,CBF的表達量則在低溫短期內快速升高,并達到最大值[37]。因此CBF1基因的表達量和抗冷性之間存在著一定的相關關系,可以作為評價番茄抗冷性的指標之一[38]。在低溫脅迫中,SlICE1與CBF1的啟動子結合,提高SlCBF1和SlDRCI7基因的表達[39]。本研究結果表明,在低溫脅迫下所有植株的SlICE1、SlCBF1、SlCBF3和SlDRCI7基因表達水平都顯著上升,并且SlBRI1轉基因植株的SlICE1、SlCBF1、SlCBF3和SlDRCI7基因的表達水平在低溫脅迫后均顯著高于MT植株。這與擬南芥相關研究結果[40]一致。這些結果表明,誘導SlBRI1的表達可能通過ICE-CBF-COR途徑提高番茄植株的抗寒能力。

該研究通過對野生型(MT)和SlBRI1過表達株系(Atrd29A:SlBRI1)進行低溫處理,較野生型而言SlBRI1過表達緩解了冷害對番茄植株Pn、Gs、Tr、Fv/Fm、ΦPS Ⅱ、Fv′/Fm′和qP降低的程度。同時,減緩植株的Ci上升。低溫脅迫后,SlBRI1轉基因植株的SlICE1、SlCBF1、SlCBF3和SlDRCI7基因表達水平均顯著高于MT植株。綜上所述,Atrd29A啟動的SlBRI1過表達能夠緩解低溫脅迫對植株光合作用的抑制,顯著提高對低溫脅迫的響應能力。