茜草葉綠體全基因組序列及其系統發育分析

陳曉穎,胡本祥,2,史嘉周,楊冰月,張 崗,彭 亮*

(1 陜西中醫藥大學 藥學院,陜西省秦嶺中草藥應用開發工程技術研究中心,“秦藥”研發重點實驗室,西安 712046;2 陜西國際商貿學院,西安 712046)

茜草(RubiacordifoliaL.),又名紅茜根、滿江紅,為茜草科(Rubiaceae)茜草屬(RubiaLinn.)多年生草質攀緣植物,廣泛分布于中國西北、華北、東北及朝鮮、印度和日本等地[1]。茜草具有極高的藥用和工業價值,其根及根莖是中國大宗中藥材品種之一,具有涼血、祛瘀、止血、通經的功效,在傳統中醫中常用于治療各種血液循環并發癥,如痛經和血瘀等[2]。現代研究表明,蒽醌及其衍生物為茜草的主要活性成分,特別是茜草素和紫羅蘭素,具有止血、抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌等多種藥理活性[3-6]。同時,茜草素和紫羅蘭素也一直被用作棉、絲和羊毛織物的重要天然染料,具有良好的藥用價值與經濟價值[7-9]。

葉綠體是綠色植物特有的半自主型細胞器,擁有源于母系遺傳的獨立基因組,在植物細胞中發揮著重要作用[10]。葉綠體基因組是1個圓形結構,具有保守的四分體結構,包括1個大單拷貝(LSC)區和1個小單拷貝(SSC)區,2個相互倒置的重復(IR)區域,LSC和SSC正好被2個序列相同但方向相反的IR序列分開[11]。與核基因組相比,葉綠體基因組結構穩定,具有分子進化速率適宜、序列高度保守、基因密集度高等優點[12]。同時,葉綠體基因組的特點是單倍體、母系遺傳、分子數量小和高度保守的序列結構,其序列變異可以為植物分類和遺傳關系提供重要理論依據[13]。鐘志敏[14]運用DNA條形碼技術,結合植物葉綠體全基因組分析,對石斛屬物種成功進行了鑒定;Cui等[15]基于3種豆蔻屬植物葉綠體基因組進行了特征比較與系統發育分析;Chen等[16]把整個葉綠體基因組用作鑒別物種的超級條形碼,對6種橐吾屬植物進行了有效識別。由此說明葉綠體基因組在研究植物進化、物種鑒定、資源開發與分子標記等方面可作為有利技術手段[17]。

茜草屬多種植物具有藥用價值,它們外觀形態相似,難以區分,在實際用藥和生產中極易因物種差異而影響治療效果[18]。研究證實,不同藥用植物的化學成分與親緣關系之間存在相關性,親緣關系越近,成分越類似[19]。因此,獲得茜草的遺傳資源信息,解析茜草及其同屬近緣種的親緣關系,可為其新藥源及其替代品的挖掘提供證據。目前,茜草的研究多集中于化學成分[20]、藥理作用[21]、非藥用部位[22]和染色[23]等方面,缺乏關于遺傳和葉綠體基因組等方面的分析。基于此,本研究運用高通量技術對茜草全葉綠體基因組進行測序、組裝、注釋,并對測序結果進行結構特征和序列變異解析;同時,選取與茜草同科共20種植物進行系統發育分析,對其親緣關系進行探討與比較,以期為之后茜草的物種鑒定與區分、資源開發與利用、系統發育等研究奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

茜草樣品采自陜西省咸陽市陜西中醫藥大學藥用植物園(108°16′26″E,34°19′3″N),經陜西中醫藥大學胡本祥教授鑒定,憑證標本保存于陜西省秦嶺中草藥應用開發工程技術研究中心。取茜草新鮮葉片,清洗干凈后液氮速凍,存放于-80 ℃冰箱。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取與測序

運用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取茜草葉片總DNA后,對其純度、降解程度、是否存在RNA及蛋白污染、濃度進行測定;合格DNA樣品運用超聲技術隨機打斷,再通過末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR 擴增等方法,構建文庫。利用Illumina高通量測序平臺HiSeq X Ten測序,獲得序列原始數據(raw data),原始數據質控合格后進行數據分析,最終得到高質量的clean data,以FASTQ格式提供[24]。

1.2.2 葉綠體全基因組序列組拼接與注釋

運用Gurevich對序列拼接軟件進行測試,以IDBA-UD和SPAdes效果最佳。本研究采用SPAdes v3.11.1拼接軟件對clean data的優化序列進行拼接和組裝,Kmer長度參數設置分別為107、117、127[25]。利用DOGMA軟件對基因內序列長度、GC含量等進行預測,并利用Geneious軟件對注釋結果進行手動校正[26];使用OGDRAW軟件繪制葉綠體全基因組圖譜[27]。最終注釋的葉綠體基因組提交至NCBI,獲得登錄號OK326894。

1.2.3 葉綠體基因組特征分析

采用MEGA11[28]進行密碼子特征分析,包括同義密碼子使用量、相對同義密碼子使用值(RSCU)、堿基組成和密碼子含量的變化特征。使用SSRHunter軟件[29-30]鑒定葉綠體基因組中的簡單序列重復序列(SSR),參數分別設置為8、5、4、3、3、3(單核苷酸至六核苷酸),且2個SSRs之間的最小距離為100 bp。SC/IR邊界使用IRSCOPE[31]進行作圖分析。mVISTA軟件[32](https://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml)做全基因組對比,分析時勾選全局對比(Shuffle-LAGAN)。

1.2.4 系統發育分析

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載茜草科茜草亞科植物Rubiahorrida(KY378689)、Rubiacordifolia(OK326894)、Galiummollugo(KY562588)、Galiumaparine(KY562587)、Paederiafoetida(KY378691)、Paederiascandens(NC_049155)、Leptodermisscabrida(NC_049160)、Hedyotisovata(MK203877)、Gynochthodesparvifolia(NC_054151)、Gynochthodesofficinalis(NC_028009)、Morindacitrifolia(KY378694)、Damnacanthusindicus(MW548283)、Saprosmamerrillii(MK203879),共13種;下載仙丹花亞科植物Coffeacanephora(NC_030053)、Coffeaarabica(NC_008535)、Mussaendahirsutula(MK203878)、Emmenopteryshenryi(KY273445),共4種;下載金雞納亞科植物Mitragynaspeciosa(KY085908)、Cinchonaofficinalis(MZ151891)、Antirheachinensis(NC_044102),共3種,所選取的三類亞科的19種植物均屬于茜草科,可直觀對樣品茜草與同科植物、同屬植物之間的親緣關系進行分析;同時,選擇玄參科植物Buddlejaalternifolia(MN395662)和Buddlejacolvilei(NC_042766)作為外類群,利用MAFFT version 7[24]軟件進行序列多重比對,輸出注釋好的文件,檢查所得結果并進行校驗;采用最大似然法(maximum likelihood method,ML)分析系統演化關系。用MEGA11軟件生成系統發育樹,除自展值Bootstrap value設為1 000外[33],其他參數設置為默認。

2 結果與分析

2.1 茜草的葉綠體基因測序結果分析

茜草葉綠體基因組共測得47 407 072條total reads,質控后獲得47 404 064條高質量的clean reads,占比率高達99.99%,組裝、拼接后獲得葉綠體基因組序列(圖1)。如圖所示,茜草葉綠體基因組為典型的四分環狀結構,基因組整體GC含量為37.2%;序列長度為153 959 bp,包括1個83 844 bp的大單拷貝區(large single-copy,LSC)、1個17 083 bp的小單拷貝區(small single-copy,SSC)和1對長度為26 516 bp反向重復區(inverted repeat region,IRs)。SSC、LSC和IR區的GC含量依次為30.9%、34.7%和40.3%(表1)。

表1 茜草葉綠體基因組堿基組成

圖1 茜草葉綠體基因組圖譜Fig.1 Gene map of Rubia cordifolia chloroplast genome

2.2 基因組成

茜草葉綠體基因組共注釋得到124個基因,包括與植物光合作用相關的基因、與自我復制相關的基因,以及一些功能未知的基因,分別為79個蛋白編碼基因、37個tRNA基因和8個rRNA基因(表2)。其中,6個tRNA基因(trnA-、trnI-、trnK-、trnL-、trnS-、trnV)、7個蛋白編碼基因(rps16、rpl2、rpoC1、ndhA、ndhB、atpF、ycf1)中各包含1個內含子, 而rps12、clpP和ycf3基因則各包含2個內含子。

表2 茜草葉綠體基因組基因

2.3 密碼子偏好性分析

茜草葉綠體基因組有64種密碼子,總長78 113 bp,GC含量為37.67%。除終止密碼子外,20種氨基酸由其他密碼子編碼而來。其中,以亮氨酸(Leu)使用最為頻繁,其數量為3 680;其次是絲氨酸(Ser),數量為2 188;使用次數最少的是半胱氨酸(Cys),數量為402。RSCU分析結果表明,在所示的64種密碼子中,有33種密碼子的RSCU>1,占總量的72.39%,其中29種以A/U結尾,4種以G/C結尾(表3)。

表3 茜草密碼子

2.4 重復序列檢測

重復序列(SSR)廣泛存在于葉綠體基因組中,常用于植物物種鑒定的研究中。在茜草葉綠體基因組中共檢測到169個SSRs,包括129個單核苷酸、18個雙核苷酸、11個三核苷酸,9個四核苷酸和2個五核苷酸,六核苷酸SSR未檢測到;其中,單核苷酸居多,以A和T組成為主,表明在堿基形成過程中A和T被頻繁使用(表4)。

表4 茜草葉綠體基因組的SSR

2.5 邊界分析

文章選取了茜草科10種植物進行葉綠體基因組邊界分析,分別為茜草亞科(6種)、仙丹花亞科(2種)和金雞納亞科(2種),從上至下依次為茜草Rubiacordifolia(OK326894)、糙葉野丁香Leptodermisscabrida(NC_049160)、雞屎藤Paederiascandens(NC_049155)、四葉葎Galiummollugo(KY562588)、原拉拉藤Galiumaparine(KY562587)、卵葉耳草Hedyotisovata(MK203877)、中粒咖啡Coffeacanephora(NC 030053)、小粒咖啡Coffeaarabica(NC_008535)、美麗帽柱木Mitragynaspeciosa(KY085908)、正雞納樹Cinchonaofficinalis(MZ151891),如圖2。結果顯示,所選取植物的葉綠體基因組共有4個邊界。茜草、四葉葎、原拉拉藤、中粒咖啡、小粒咖啡和美麗帽柱木的JLB(LSC/IRb)位于rps19基因編碼區內,且向IRb區有14～95 bp的擴張;正雞納樹的JLB邊界則位于rpl16基因上,向IRb區擴張了193 bp;糙葉野丁香JLB邊界位于rps19和trnH基因之間;雞屎藤的JLB邊界位于rps19和rps12之間;僅卵葉耳草JLB(LSC/IRb)邊界位于rps22和rps19之間。

圖2 茜草科植物葉綠體基因組的IR/SC邊界變化情況Fig.2 Changes of IR/SC boundary of chloroplast genomes of Rubiaceae species

在JSB(IRb/SSC)邊界區,茜草缺失ycf1基因;除中粒咖啡、小粒咖啡和美麗帽柱木外,其他6種植物JSB邊界均位于在SSC區的ndhF基因之內,且向IRb邊界擴張了5～76 bp。10種植物的JSA(SSC/IRa)邊界均位于ycf1基因內,長度向IRa區域不同程度擴張,為1 057～1 919 bp;在JLA(IRa/LSC)的邊界處,10種植物均含有trnH基因,但糙葉野丁香的trnH基因位于IRa區域,其他9種植物則位于LSC區;茜草、雞屎藤、四葉葎和美麗帽柱木的JLA邊界位于rpl2與trnH基因之間;原拉拉藤、卵葉耳草、中粒咖啡和小粒咖啡的JLA邊界則位于rps19與trnH基因之間;正雞納樹的JLA邊界位于rps3和trnH之間;僅有糙葉野丁香的JLA邊界位于trnH與psbA基因之間。

從以上分析結果來看,茜草屬不同亞科植物在進化過程中IR邊界區中存在一定的收縮和擴張,且不同物種之間存在部分差異,但總體來說,IR區的變化幅度較小,葉綠體基因組較為保守。

2.6 茜草葉綠體基因組序列變異分析

以茜草(OK326894)葉綠體基因組作注釋,使用mVISTA在線工具進行葉綠體基因組全序列對比分析(圖3)。如圖3所示,茜草科植物葉綠體基因組的基因區間組成差異性較小,較為一致。結合邊界分析,可見本文所選茜草科植物總體上LSC、SSC區域變異程度高,大于IR區;從四大區段來看,LSC區變化異性最大,IRA區變化差異性最小,最為保守。從非基因編碼區和基因編碼區來看,非基因編碼區變異程度較高,基因編碼區較為保守,但在rps16、rpoB、ycf3、clpP、ndhF、ndhA和ycf1等基因編碼區變異程度較大,存在顯著差異。

圖3 茜草科植物葉綠體基因組序列比對分析Fig.3 Genome sequence alignment of Rubiaceae chloroplasts

2.7 系統發育分析

以茜草科3個亞科(茜草亞科、仙丹花亞科、金雞納亞科)共20種植物為內類群,同時選取玄參科2種植物為外類群,采用最大似然法(ML法)構建植物系統發育樹(圖4)。結果表明,茜草Rubiacordifolia(OK326894)與登錄號為KY378689的Rubiahorrida以100%支持率聚為一類,兩者親緣關系好;茜草屬、拉拉藤屬、雞屎藤屬共6種植物與糙葉野丁香、卵葉耳草聚為一小支;羊角藤屬2種植物與海濱木巴戟、虎刺、瓊島染木樹聚為一小支;兩小支構成姐妹類群,支持率均為100%,為茜草亞科組。仙丹花亞科組4種植物與金雞納亞科組3種植物共同聚為一支,除咖啡屬粗毛玉葉金花、美麗帽柱木正雞納樹這個節點支持率分別為97%、81%外,其他節點均為100%。

圖4 基于22個物種葉綠體基因組序列構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed with 22 species chloroplast genome sequences

3 討 論

茜草是一種分布廣泛的多年生植物,最初以天然植物染料見于《詩經》中,后其根及根莖作為中藥被記載于《神農本草經》中[34]。作為天然植物染料用,茜草染色效果好、著色牢固,中國、印度、波斯等地區曾先后將其用于棉、麻、絲、皮革的染色[35]。現代研究中,茜草也可用于合成材料如滌綸的染色[36]。作中藥用,茜草具有涼血、止血、化瘀、通經的作用,臨床多用于治療血熱引起的各種崩漏出血、腫瘤以及跌打損傷腫痛等癥狀[2]。可知,茜草具有極高的藥用價值與經濟價值,應用歷史悠久。葉綠體基因組是被子植物中的保守結構,Daniell等[37]表明植物葉綠體基因組呈四分環狀,長度在107～218 kb之間,包括小單拷貝區18～20 kb、大單拷貝區81～90 kb以及2個反向重復區20～30 kb。本研究中,通過測序、組裝和注釋獲得的茜草葉綠體全基因組序列長度為153 959 bp(GC含量37.2%),其中大單拷貝區83 844 bp、小單拷貝區17 083 bp、反向重復序列區26 516 bp,符合被子植物葉綠體的特征結構[38];同時,與已發表的茜草同屬植物紫參(155 108 bp,36.98%)[39]、同科植物丁茜(152 407 bp,37.63%)[40]相比,三者基因組大小、結構和組成以及GC含量高度相似,證明茜草科植物在進化過程中有良好的保守性。

密碼子在生物體遺傳信息傳遞中起著重要的作用,作為紐帶聯系核酸、蛋白質和遺傳物質,其偏好使用對研究基因功能、物種進化等問題提供了可靠的信息[41-42]。本研究中茜草葉綠體基因組對A/U結尾密碼子的偏好性高于G/C結尾密碼子,這與李亞磷等[43]對茜草同科植物小粒咖啡的密碼子偏好分析一致,說明物種之間親緣關系越近,密碼子偏好性使用越類似,印證了Liu等[44]的結論。簡單重復序列(SSR)廣泛分布于大多數植物中,主要存在于基因外部和基因非編碼區,常被用在物種鑒定、遺傳多樣性分析及分子標記輔助育種等方面[45]。在本研究中茜草葉綠體基因組中共檢測到169個SSR位點,單核苷酸最多,雙核苷酸次之,且SSR位點多以A/T、AT/AT、AAT/ATT、AAAT/ATTT組成,證明茜草葉綠體基因組在堿基形成中A、T被頻繁使用,這與已發表的其他植物葉綠體基因組結果[46]相似,檢測到的SSR位點可為后續茜草的物種鑒別、親緣關系分析和分子標記提供理論依據。除此之外,反向重復區的收縮、擴張和缺失都會引起葉綠體基因組的差異[47],對茜草科植物的 IR/SC 邊界和序列變異分析發現,SSC/IR邊界區域差異性較大,LSC/IR區域差異變化小,但總體來說,整個基因組仍然較為保守;存在部分差異的區域,可為茜草科不同物種鑒定和系統發育分析提供分子依據。

為了進一步揭示茜草科物種間親緣關系,本文選取了20種茜草科植物以及玄參科2種植物作為外類群建立ML系統發育樹。結果顯示,樣品茜草(OK326894)與同屬植物Rubiahorrida以100%支持率聚為一類,茜草亞科、仙丹花亞科與金雞納亞科聚為姐妹類群,除咖啡屬-粗毛五葉金花、美麗帽柱木-正雞納樹這2個節點支持率分別為97%、81%,其他節點均為100%。此系統發育與同屬植物紫參[39]分析結果相似,但本文增加了除茜草亞科以外的其他兩種亞科的植物構建系統發育樹,完善了茜草科植物的進化關系,證明茜草科植物在進化過程中保守發育。茜草科植物約有600多個屬,13 000余種,在中國約有98屬近700種[40],《中國藥典》中僅收錄有茜草RubiacordifoliaL.的根及根莖,部分同屬植物被地方所收錄;茜草偽品較多,除同屬之間物種形態相似易混用之外,還有非同屬植物被混作藥用,市場上常將茜草科植物蓬子菜GaliumverumL.、唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaB.作為茜草混偽品使用,陳一龍等[48]運用DNA條形碼技術對茜草及其混偽品進行了鑒別,但并未區分茜草屬其他物種;本研究通過對茜草葉綠體基因組的全面解析,明確了其葉綠體因組的序列特征和系統發育關系,為準確鑒定茜草及其近緣物種提供分子依據,為茜草在藥材選用、市場流通以及真偽品鑒別等實際應用方面提供數據參考。