基于葉綠體基因組數據的蕓香科屬間系統發育初步分析

劉 涵,孫 沖,吳 杰,黃 威,黃勤琴,劉 霞,4*

(1 重慶文理學院 園林與生命科學學院,重慶 402160;2 重慶三峽學院 生物與食品工程學院,重慶 404000;3 長江大學 園藝與園林學院,湖北荊州 434025;4 西南大學 園藝與園林學院,重慶 400799)

蕓香科(Rutaceae)中許多植物以具重要的藥用、經濟和觀賞價值而聞名,如花椒屬(ZanthoxylumL.)物種[1]。蕓香科從屬于蕓香目(Rutales),約150屬,1 600種,分布于世界各地,中國有28屬,約151種,28變種,主要分布在中國西南和南方地區[2]。基于分子系統研究結果表明,蕓香科是單系類群[3];然而,蕓香科下亞科的劃分爭議較大。被子植物分類系統(angiosperm phylogeny group,APG)將蕓香科劃分為蕓香亞科(Rutoideae)、柑橘亞科(Aurantioideae)、戟葉橄欖亞科(Cneoroideae)和脂檀亞科(Amyridoideae)4個亞科。根據果實和雌蕊形態,Engler系統將該科細分為蕓香亞科、柑橘亞科、飛龍掌血亞科(Toddalioideae)、巨盤木亞科(Flindersioideae)、Rhabdodendroideae、Dictyolomatoideae和Spathelioideae 7個亞科[4],其中僅前4個亞科在中國有分布。

前人研究表明,物種多樣性最高的蕓香亞科和飛龍掌血亞科物種關系很大程度上是混雜的,蕓香科的模式屬蕓香屬與柑橘亞科關系更為密切[5-6]。Poon等[7]通過2個葉綠體片段和核基因標記表明吳茱萸屬(TetradiumLour.)、黃檗屬(PhellodendronRupr.)和飛龍掌血屬(ToddaliaJuss.)是花椒屬的近親屬。Poon等[7]和Groppo等[8-9]發現花椒屬與飛龍掌血屬為姊妹類群,而黃檗屬則嵌套在吳茱萸屬中。Appelhans等[1]根據5個葉綠體和核基因標記,認為飛龍掌血屬可能嵌套在花椒屬內。盡管前人對蕓香科植物做了大量的研究,但僅使用有限數量的葉綠體和核基因標記來推斷該科的系統發育關系,系統發育樹中一些重要節點的分辨率較低。目前,在更廣泛的分類群采集和大量分子數據使用的基礎上,尚沒有得到1個完整的蕓香科系統發育樹框架。此外,由于系統發育樹支持率較低,以及在以往研究中使用的分子標記有限,花椒的近親屬還有待進一步闡明。完整的葉綠體基因組(chloroplast DNA, cpDNA)序列為系統發育特征提供了豐富的生物信息,有助于深入了解蕓香科亞科之間以及花椒屬及其近緣屬之間的進化關系。

葉綠體基因組大小適中,基因含量和結構相對保守,核苷酸替代率低,為植物進化和系統發育研究提供了充足的資源[10],已有研究證明葉綠體基因組序列具有在不同分類水平上解決系統發育關系的潛力[11]。近年來,葉綠體基因組被用于不同分類水平的分析,例如,李巖等[12]基于葉綠體基因組數據比較分析了十字花科(Brassicaceae Burnett)22個屬22個物種的系統進化關系,結果表明利用葉綠體基因組數據可以解決十字花科植物的系統分類和系統發育關系。路東曄等[13]分析了臭柏(JuniperussabinaL.)葉綠體基因組結構特征及系統進化關系,豐富了臭柏的遺傳信息。Xu等[14]基于葉綠體基因組序列建立了風毛菊屬(SaussureaDC.)系統發育框架,各分支具有較高支持率。Zong等[15]利用葉綠體基因組序列解析了楊屬(PopulusL.)物種的親緣關系。段義忠和張凱[16]對沙冬青[Ammopiptanthusmongolicus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.]和矮沙冬青[Ammopiptanthusnanus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.]葉綠體基因組進行了測序,分析了其葉綠體基因組結構和系統發育關系,為沙冬青屬的種間鑒別和分子標記的開發等奠定了理論基礎。馬孟莉等[17]對姜科(Zingiberaceae)豆蔻屬(AmomumRoxb.)陽春砂(AmomumvillosumLour.)葉綠體基因組進行了測序,揭示了陽春砂與其他姜科植物的進化關系。Wen等[18]報道了野木瓜(StauntoniachinensisDC.)葉綠體基因組序列,并對木通亞科(Lardizabaloideae)植物的葉綠體基因組進行比較分析,揭示了其適應性進化。本研究對蕓香科中12個物種進行了葉綠體基因組測序,組裝和注釋,獲得其葉綠體全基因組序列,結合數據庫中已公布的蕓香科物種的葉綠體基因組序列,共46個物種,選擇苦木科(Simaroubaceae)和橄欖科(Burseraceae)共3個物種作為外類群,對分布于中國的蕓香科植物進行了分子系統發育分析。由于巨盤木亞科物種材料和葉綠體全基因組數據的缺乏,該亞科未納入本研究中。利用葉綠體基因組數據對中國蕓香科屬水平的親緣關系進行了系統發育重建,有助于加深理解中國蕓香科屬間系統進化關系,同時明確花椒屬的近緣屬類群,為下一步進行花椒屬種間的系統進化關系研究選擇合適外類群提供數據參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

研究共獲得蕓香科46個物種的葉綠體全基因組序列,其中12個物種為本研究新測序獲得,序列登錄號及詳細的樣品信息見表1。

表1 研究所用樣本的信息

其余物種包括3個外類群物種的葉綠體全基因組序列均從GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)數據庫獲得。植物標本存放于重慶文理學院園林與生命科學學院。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取和測序

采用CTAB法[19]或植物基因組DNA植物試劑盒(天根生化科技有限公司)提取植物硅膠干燥葉片的總基因組DNA。質檢合格后的DNA,送廣州佰數生物科技有限公司在BGISEQ-500平臺進行測序,雙末端測序讀取長度為150 bp。

1.2.2 葉綠體全基因組的組裝和注釋

為保證后續組裝質量,對測序獲得的原始數據(raw data)進行過濾,去掉帶接頭的reads,去掉N含量超過10%的短序列,過濾測序質量值小于Q20,對過濾后的reads用SPAdes Assembler v3.9.0軟件[20]組裝葉綠體基因組,使用GapCloser v1.12軟件對組裝后的結果進行補洞和堿基校正,在Chlorobox[21]中使用CpGAVAS[22]軟件進行基因組注釋。使用MAFFT v7.0軟件[23]進行序列比對。

1.2.3 系統發育樹構建

系統發育樹重建分別采用最大似然法(maximum likelihood,ML)和貝葉斯法(bayesian inference,BI),ML分析用RAxML v 8.2.12軟件[24]進行,使用jModeltest 2.0軟件[25]確定最佳核苷酸替代模型為GTR+G+I,按照AIC(Akaike information Criterion)信息標準檢測模型對數數據的擬合程度。采用MrBayes v.3.2.1[26]進行BI分析。馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMC)算法運行1 000萬代,每1 000代取樣1次,運行結果前25%作為burn-in,其他參數設置為默認值。

2 結果與分析

2.1 葉綠體全基因組特征

新測序的花椒屬物種組裝好的葉綠體基因組全長范圍在157 304(兩面針)～159 072 bp(野花椒)之間,具有典型的四分體結構,包括大單拷貝區、小單拷貝區和2個反向重復區。花椒屬物種葉綠體基因組除川陜花椒包含133個基因,其余均包含132個基因,GC含量均大于38%,柑橘、吳茱萸和川黃檗葉綠體基因組長度分別為160 698 bp、158 762 bp和158 490 bp。對所獲得的49個物種的葉綠體基因組序列進行比對,用于進化分析的葉綠體基因組序列總長度為196 641 bp,葉綠體基因組序列具有26 747個變異位點,其中12 670個是簡約性信息位點。

2.2 蕓香科間系統發育關系分析

2種方法ML和BI構建的系統發育樹具有相同的拓撲結構,僅在某些進化支的支持率(PP/BS)上存在差異(圖1)。基于葉綠體基因組數據構建的系統進化樹各分支分辨率較高,這可能與葉綠體基因組序列含有較高的生物信息位點有關,從而獲得了蕓香科物種間穩健的系統發育關系。蕓香科物種聚為1個單系類群,科下物種進一步分為兩大分支,其中單系的柑橘亞科與蕓香亞科的蕓香屬聚為1個分支,蕓香亞科和飛龍掌血亞科聚為另一分支,該兩亞科均不是單系,其中飛龍掌血亞科的香肉果屬,茵芋屬與蕓香亞科的白鮮屬,臭常山屬是最早分化出來的類群,其次是蜜茱萸屬和山油柑屬。

支持率(BS/PP)<100或<1顯示在分支的上方。圖1 基于葉綠體基因組數據重建的蕓香科系統發育樹Support values (BS/PP) either <100 or <1 are shown above the branches.Fig.1 Phylogenetic tree of the Rutacese based on the chloroplast genome data

蕓香亞科和飛龍掌血亞科之間的系統發育關系很大程度上是混合的,模式屬蕓香屬既不屬于蕓香亞科也不屬于飛龍掌血亞科,而是與柑橘亞科的關系更為密切,這與其他的系統發育分析結果基本一致。

2.3 花椒屬及其近緣屬間的系統發育關系分析

所有的花椒屬物種聚為1個單系(BS=100%,PP=1)。黃檗屬和吳茱萸屬與花椒屬(Zanthoxylum)類群形成姊妹關系(BS=100%,PP=1),飛龍掌血嵌套于花椒屬內,這與Appelhans等[1]研究結果一致,2個屬應該進行合并。來自印度洋群島的2個花椒物種(Z.madagascariense和Z.paniculatum)最早分化出來,為花椒屬物種的基部類群,飛龍掌血屬物種飛龍掌血嵌套于花椒屬分支中,與尖葉花椒、石山花椒、青花椒和來自南太平洋群島湯加的Z.pinnatum物種形成姊妹關系。來自南太平洋群島的Z.tragodes位于另1個亞分支的基部,與其他花椒物種形成姊妹關系,各分支有較高的支持率。

3 討 論

根據進化樹,蕓香亞科和飛龍掌血亞科之間的關系很大程度上是混合的,模式屬蕓香屬不屬于蕓香亞科和飛龍掌血亞科,而與柑橘亞科關系更密切(圖1)。蕓香亞科、飛龍掌血亞科和柑橘亞科的系統發育關系很大程度上不符合根據形態來定義蕓香科植物的恩格勒分類體系[4]。該研究的結果與最近基于幾個葉綠體和核基因標記重建的蕓香科系統發育樹結果[5-6]基本一致,但該研究的系統發育樹具有相對較高的支持率。因此,傳統的亞科分類并不能反映蕓香科的系統進化關系。最近,有研究學者提出將柑橘亞科、巨盤木亞科、蕓香亞科和飛龍掌血亞科合并。其中,柑橘亞科、蕓香亞科和飛龍掌血亞科之間的關系非常密切,該研究的分子系統研究證實了這一點。遺憾的是,在該研究中沒有收集到巨盤木亞科的材料,為了全面解決中國蕓香科的分類學問題,在未來的分析中還需要加入巨盤木屬(Flindersia)物種。

黃檗屬(Phellodendron)、吳茱萸屬(Tetradium)和飛龍掌血屬(Toddalia)曾一直被認為是花椒屬的近親屬,并形成1個單系分支[8]。Poon等[7]和Groppo等[8]指出,花椒屬和飛龍掌血屬是姊妹類群關系,而黃檗屬則嵌套在吳茱萸屬內。該研究結果表明,黃檗屬和吳茱萸屬形成1個亞分支,彼此形成姊妹關系。雖然黃檗屬和吳茱萸屬在果實結構上有很大的不同(前者是開裂的蓇葖果,后者是肉質核果),但Hartley[27]發現根據植物營養物質或雄蕊材料是不可能區分開這2個屬。先前的分子研究也表明這2個屬有密切的親緣關系[7,28]。在本研究中,基于葉綠體基因組數據構建的系統進化樹也支持黃檗屬和吳茱萸屬的姐妹群關系(BS=100%,PP=1)。花椒屬和單屬單種的飛龍掌血物種形成另1個亞分支(BS=100%,PP=1)。花椒屬和飛龍掌血屬的相似性不僅得到了分子數據的支持,而且化學特征[7,28]也表明二者具有較近的親緣關系。在過去的分子系統發育研究中,飛龍掌血屬被認為可能與花椒屬是姊妹關系,或者嵌套在花椒屬內[29]。此外,Appelhans等[29]提出將飛龍掌血(Toddaliaasiatica)的拉丁名改為Zanthoxylumasiatica(L.) Appelhans,Groppo &J.Wen,comb.nov。該研究結果表明,飛龍掌血(T.asiatica)嵌套在花椒屬內,證實了飛龍掌血屬是花椒屬譜系的一部分,支持將這2個屬合并。

該研究利用高通量測序技術完成了蕓香科12個物種葉綠體基因組測序、組裝和注釋,并基于葉綠體基因組數據獲得了高分辨率的蕓香科下及關鍵屬間的系統發育樹,雖然豐富了蕓香科的遺傳資源,加深了對蕓香科植物系統發育關系的理解,但遺憾的是,在該研究中未包括巨盤木亞科物種的材料,基于葉綠體基因組數據構建蕓香科植物的系統進化關系還不夠全面,在以后研究中需要加入該亞科的物種,利用更多的基因組數據來挖掘和完善蕓香科的系統進化關系。