基于農(nóng)藝性狀的榕江茶核心種質(zhì)構(gòu)建

吳河饒,任青艷,陳 瑩,崔 葉,陳思冶,黃大玉,陳濤林

(貴州大學 茶學院,貴陽 550025)

茶樹種質(zhì)資源是茶樹品種選育的物質(zhì)基礎(chǔ),也是茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略性資源[1]。榕江茶(CamelliayungkiangensisH. T. Chang)分布于貴州省榕江縣月亮山一帶,本課題組前期的主要茶品質(zhì)化學成分檢測結(jié)果顯示,其混合樣品茶多酚含量很高(33%),咖啡堿含量極低(0.10%),而作為咖啡堿合成前體的可可堿含量較高(3.77%),屬于典型的“高茶多酚、低咖啡堿、高可可堿”類型的資源,而且加工紅茶品質(zhì)獨特[2],在茶樹新品種選育、茶葉新產(chǎn)品開發(fā)和茶葉深加工等方面具有很好的開發(fā)潛力和利用價值。然而,由于該野生茶資源群體較大,個體數(shù)量較多,對該資源的高效利用和保護構(gòu)成了挑戰(zhàn)。因此,合理構(gòu)建該資源的核心種質(zhì),對其優(yōu)異種質(zhì)的發(fā)掘利用和高效保護具有重要的指導意義[3]。

Frankel[4]早在1984年提出核心種質(zhì)的概念,即從原始種質(zhì)中選取一部分能以最小資源數(shù)量最大程度代表整體種質(zhì)遺傳多樣性的資源。近年來,核心種質(zhì)構(gòu)建的研究進展如火如荼,目前已在蘋果[5]、花生[6]、玉米[7]等植物中構(gòu)建核心種質(zhì)。同時,核心種質(zhì)的構(gòu)建方法也在不斷發(fā)展。李自超等[8]基于水稻表型數(shù)據(jù)構(gòu)建出初級核心種質(zhì),利用生化指標和群體表型性狀進行壓縮得到二級核心種質(zhì),最后利用分子標記對二級核心種質(zhì)再次壓縮,完成了初級核心種質(zhì)的動態(tài)更新,最終得到核心種質(zhì)。此外,植物核心種質(zhì)不再單一地進行構(gòu)建,而是轉(zhuǎn)向研究與利用的趨勢發(fā)展,如水稻微核心種質(zhì)產(chǎn)量相關(guān)的QTL定位[9]、甜菜重要農(nóng)藝性狀相關(guān)等位基因的開發(fā)[10]、中國大豆與國際大豆核心種質(zhì)的遺傳多樣性比較[11]等。目前關(guān)于茶樹種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析的報道較多,如蔣會兵等[12]、楊盛美等[13]和張明澤等[14]分別利用形態(tài)學、生化成分和分子標記等手段對茶樹的遺傳多樣性進行了分析研究,但針對茶樹核心種質(zhì)資源構(gòu)建的研究鮮有報道。

本研究以分布于貴州黔東南苗族侗族自治州榕江縣月亮山境內(nèi)的118份榕江茶種質(zhì)資源為材料,在性狀調(diào)查和品質(zhì)成分測定數(shù)據(jù)整理工作的基礎(chǔ)上,通過比較基于2種遺傳距離(標準化歐氏距離、馬氏距離)、4種聚類方法(離差平方和法、非加權(quán)組平均法、最長距離法、最短距離法)和7種總體取樣規(guī)模(10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%)排列組合構(gòu)建56份備選核心種質(zhì),對備選核心種質(zhì)進行有效性檢驗,最終獲得榕江茶核心種質(zhì)構(gòu)建的最佳方案并構(gòu)建其初級核心種質(zhì),并對構(gòu)建的榕江茶核心種質(zhì)進行評價和驗證,為進一步研究榕江茶核心種質(zhì),高效收集、利用榕江茶種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

該研究以分布在貴州省黔東南苗族侗族自治州榕江縣月亮山境內(nèi)(平均海拔約1 200 m)的榕江茶(Camelliayungkiangensis)為對象。在實地考察的基礎(chǔ)上選取具有代表性的單株資源121份,依地理位置分別編號為RJ001-RJ121。對每份單株資源進行GPS定位,對其整株和芽葉形態(tài)進行觀測和記錄。根據(jù)陳亮等[15]編著的《茶樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》規(guī)定的方法,于2022年4月中旬對118份榕江茶單株資源的形態(tài)特征進行觀測記錄,選取的性狀主要包括樹型、葉尖形狀、葉片著生角度、葉基形狀、葉身、葉面、葉緣、葉質(zhì)、葉齒深度、葉齒銳度、葉齒密度、成熟葉顏色、樹姿等13個質(zhì)量性狀,葉長、一芽二葉長度、葉寬、葉脈對數(shù)、葉面積、百芽重等6個數(shù)量性狀,以及水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿含量等4個品質(zhì)指標,共計23個農(nóng)藝性狀。對每份資源的數(shù)量性狀(葉長、葉寬、葉面積和葉脈對數(shù))隨機測量33張葉片,取其平均值;隨機選取100個標準一芽二葉,其總重量記為百芽重,從中隨機選取33個測其長度,取其平均值記為一芽二葉長;水浸出物、茶多酚、游離氨基酸等品質(zhì)成分的含量分別按照相應(yīng)的國家標準(GB/T 8305—2013、GB/T 8313—2018、GB/T 8314—2013)進行測定,咖啡堿含量測定參考王麗麗等[16]和楊金川等[17]的方法。一芽二葉的基本生化成分共計實測121株,其中數(shù)據(jù)齊全的單株資源共有118株。

1.2 數(shù)據(jù)的賦值標準

按照陳亮等[15]于2005年編著的《茶樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》規(guī)定的方法,對每份資源的質(zhì)量性狀均重復觀測10次,按照等級數(shù)量編碼方法進行分級賦值。

1.3 核心種質(zhì)的構(gòu)建方法

1.3.1 數(shù)據(jù)分組與聚類分析的方法

依據(jù)各榕江茶種質(zhì)資源的葉齒銳度將118份種質(zhì)資源劃分為3組。參考前人總結(jié)出的層次聚類法進行系統(tǒng)聚類[19]。組內(nèi)聚類得到聚類樹狀圖,從遺傳距離最近的組內(nèi),選擇具有特殊農(nóng)藝性狀的1份材料,若組內(nèi)無具有特殊農(nóng)藝性狀的材料則隨機選擇1份進入下一輪聚類,重復多次聚類,直至剩余材料總數(shù)達到每組所需的取樣材料數(shù)。聚類程序和部分統(tǒng)計計算由SPSS 23.0和WPS 2019軟件完成,圖表由Origin 22.0和Adobe Photoshop 2022進行繪制。

1.3.2 構(gòu)建策略的篩選

在分組和層次聚類分析的基礎(chǔ)上,組內(nèi)取樣方法采用對數(shù)比例法(表1),在控制群體遺傳冗余度的同時,適當增加稀有葉齒銳度的取樣數(shù)量,以平衡葉齒銳度的取樣[20]。對3個聚類分析基本環(huán)節(jié)進行分析,即兩種常用遺傳距離:歐氏距離(Euclidean distance)、馬氏距離(Mahalanobis distance);4種聚類方法:離差平方和法(Ward’s method)、非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)、最長距離法(complete linkage)、最短距離法(single linkage);7種總體取樣規(guī)模:10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%。將不同的遺傳距離、聚類方法和總體取樣規(guī)模進行排列組合,共形成56種構(gòu)建策略,分別對構(gòu)建56份備選核心種質(zhì)進行討論。同時,采用表型保留比例(RPR)、變異系數(shù)變化率(VR)、極差符合率(CR)和Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(I)等4個評價指標比較備選核心種質(zhì)優(yōu)劣并選擇最佳構(gòu)建策略。

表1 對數(shù)比例策略在不同總體取樣規(guī)模下的各組取樣比例

1.4 核心種質(zhì)的驗證

利用獲得的最佳構(gòu)建方案構(gòu)建榕江茶初級核心種質(zhì)。對已構(gòu)建完成的初級核心種質(zhì)進行評價,采用特征值和評價指標檢驗核心種質(zhì)有效性。

特征值檢驗利用原始種質(zhì)和初級核心種質(zhì)的23個性狀的最小值、最大值、均值、標準差、變異系數(shù)、Shannon-Weaver多樣性指數(shù)6個特征值檢驗核心種質(zhì)的均勻程度和變異范圍。評價指標檢驗利用表型保留比例(RPR)、變異系數(shù)變化率(VR)、極差符合率(CR)、最大值變化率(CRmax)、最小值變化率(CRmin)、平均值變化率(CRmean)、均值差異百分率(MD)和方差差異百分率(VD)8個評價指標驗證初級核心種質(zhì)有效性。同時對原始種質(zhì)和初級核心種質(zhì)的23個農(nóng)藝性狀進行t檢驗和F檢驗,驗證核心種質(zhì)對原始種質(zhì)的代表性和差異顯著性。特征值和評價指標參考劉遵春等[5]和劉娟[3]的公式計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 總體取樣規(guī)模的篩選

依據(jù)葉齒銳度將118份榕江茶種質(zhì)資源劃分為銳、中、鈍等3組,組內(nèi)取樣方法使用對數(shù)比例法。分別計算56個備選構(gòu)建策略核心種質(zhì)的5個評價指標,即Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(I)、變異系數(shù)變化率(VR)、表型保留比例(RPR)、極差符合率(CR)和均值差異百分率(MD)。由表2可知,除10%總體取樣比例的備選核心種質(zhì)外,各備選核心種質(zhì)的VR均高于107%,RPR均高于94%;I均高于1.12,CR均在92%以上。

表2 不同構(gòu)建策略的比較

從表2還可以看出,以歐式距離聚類的核心種質(zhì)中,Shannon-Weaver多樣性指數(shù)隨取樣規(guī)模升高表現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢,在總體取樣規(guī)模為30%時達到最大值;而在以馬式距離聚類的核心種質(zhì)中,Shannon-Weaver多樣性指數(shù)隨取樣規(guī)模升高表現(xiàn)的規(guī)律性不明顯,總體取樣規(guī)模在30%、35%和40%時,多樣性指數(shù)較大,且三者間的差異較小。這說明低取樣規(guī)模覆蓋品種太少,不利于保存足夠豐富且均勻的變異;隨著總體取樣規(guī)模的不斷升高,核心種質(zhì)的遺傳冗余度也隨之升高。

同時,核心種質(zhì)的VR在總體取樣規(guī)模為20%時均高于110%,以后隨著取樣規(guī)模的上升會逐漸降低;核心種質(zhì)的RPR隨著總體取樣規(guī)模的升高呈遞增趨勢,在取樣規(guī)模達30%時上升幅度趨于平緩;核心種質(zhì)的CR在取樣規(guī)模為10%和20%時普遍表現(xiàn)不佳;除A1S3-35、A1S1-30 2個核心種質(zhì)外,其余核心種質(zhì)MD均小于10%,未表現(xiàn)出明顯規(guī)律性。

綜合7種取樣規(guī)模的5種評價指標,當總體取樣規(guī)模達到30%時,核心種質(zhì)擁有較高的遺傳多樣性指數(shù),且能夠在基本保留全部性狀的前提下保持較高的VR和100%的CR,因此,30%的取樣比例是榕江茶核心種質(zhì)構(gòu)建的最佳總體取樣規(guī)模。

2.2 遺傳距離的篩選

在確定取樣規(guī)模為30%的基礎(chǔ)上,采用標準化歐氏距離構(gòu)建的核心種質(zhì),CR均為100%,VR均高于108%,Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(I)也能夠保持在1.3以上,除A1S2-30、A1S4-30核心種質(zhì)的VR略低于采用馬氏距離構(gòu)建出的核心種質(zhì)A2S2-30、A2S4-30外,其余核心種質(zhì)的Shannon-Weaver多樣性指數(shù)、VR和RPR均優(yōu)于以馬氏距離所構(gòu)建的核心種質(zhì)(表2)。這進一步驗證了標準化歐氏距離更適于處理含有較多不同類型性狀的種質(zhì)資源群體的觀點[22]。

綜上所述,以標準化歐氏距離構(gòu)建的核心種質(zhì)中,CR、VR和Shannon-Weaver多樣性指數(shù)的結(jié)果更加優(yōu)異,構(gòu)建出的核心種質(zhì)變異豐富且分布均勻,能夠更好地代表原種質(zhì)的遺傳多樣性,而VR與以馬氏距離構(gòu)建的核心種質(zhì)有個別相對偏低,但其平均值相對較高,差異并不顯著。因此在構(gòu)建榕江茶核心種質(zhì)時,采用標準化歐氏距離效果較好。

2.3 聚類方法的篩選

利用30%總體取樣規(guī)模和標準化歐氏距離,比較4種聚類方法構(gòu)建出的備選核心種質(zhì),結(jié)合表2發(fā)現(xiàn),用最短距離法構(gòu)建的核心種質(zhì)表現(xiàn)最優(yōu),Shannon-Weaver多樣性指數(shù)最高,變異系數(shù)變化率高達110.22%,極差符合率達100%,能夠保留原種質(zhì)全部極差,表型保留比例(98.45%)略低,但缺少的2個性狀后續(xù)可以將其補充。與最短距離法相比,最長距離法和離差平方和法構(gòu)建的核心種質(zhì)的表型保留比例較低;而非加權(quán)組平均法構(gòu)建的結(jié)果與其相近,但其Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(1.324)、變異系數(shù)變化率(109.93%)、表型保留比例(97.67%)均略低于最短距離法構(gòu)建的核心種質(zhì)。這與多年生作物中,最短距離法對白樺[23]核心種質(zhì)構(gòu)建效果最好的研究結(jié)果相吻合。

從全部56份備選核心種質(zhì)來看,采用最短距離法、30%總體取樣規(guī)模和標準歐氏距離構(gòu)建的核心種質(zhì)在能夠保留全部性狀的基礎(chǔ)上,擁有最高的遺傳多樣性指數(shù),相較于其他構(gòu)建策略綜合表現(xiàn)最好,在保證較少遺傳冗余度的同時能夠很好地代表原種質(zhì)遺傳多樣性,是構(gòu)建榕江茶核心種質(zhì)的最佳策略。

2.4 核心種質(zhì)的評價

采用標準化歐氏距離、最短距離法和30%總體取樣規(guī)模構(gòu)建初級核心種質(zhì)(A1S1-30),在初選核心種質(zhì)取樣量上,人工定向補充2份具有特殊性狀但未選入的種質(zhì)資源,最終確定38份榕江茶資源組成核心種質(zhì),取樣比例占原種質(zhì)的32.20%。對其進行特征值和評價指標的計算,并與原種質(zhì)進行比較(表3),可見核心種質(zhì)與原種質(zhì)23個性狀的6個特征值相似性較高,且核心種質(zhì)各性狀的遺傳多樣性指數(shù)有一定程度的提升。

表3 榕江茶原始種質(zhì)與核心種質(zhì)性狀特征值比較

同時,t檢驗結(jié)果(表4)表明,原種質(zhì)與核心種質(zhì)的葉基、葉緣、樹姿3個性狀具有顯著差異,方差齊性檢驗結(jié)果表明原種質(zhì)與核心種質(zhì)的百芽重、一芽二葉長、葉緣3個性狀具有顯著差異。這主要由于葉緣、葉基2個性狀中存在有較多的稀有性狀,且分布極不均衡,百芽重、一芽二葉長和樹姿3個性狀的變異幅度較大,分布較為極端。核心種質(zhì)在此基礎(chǔ)上平衡了變異的分布,有效保留了原種質(zhì)的遺傳多樣性。

表4 核心種質(zhì)與原始種質(zhì)各性狀評價參數(shù)和t檢驗、F檢驗

另外,核心種質(zhì)和原種質(zhì)的主成分分析結(jié)果(表5)顯示,原種質(zhì)在第10個主成分時特征值開始小于1,第9個主成分的特征值為1.04,累計貢獻率為71.99%;核心種質(zhì)在第11個主成分時特征值開始小于1,第10個主成分的特征值為1.06,累計貢獻率為82.27%。可見,核心種質(zhì)的貢獻率要高于原種質(zhì),有效地避免了核心種質(zhì)的冗余。

表5 原種質(zhì)和核心種質(zhì)主成分分析的特征值和累積貢獻率

此外,為了進一步對核心種質(zhì)庫進行確認,基于23個農(nóng)藝性狀主成分分析提取的第1、第2和第3主成分因子得分繪制核心種質(zhì)和原種質(zhì)的分布圖(圖1)。從圖1可看出,補充種質(zhì)進一步豐富了核心種質(zhì)的分布范圍,核心種質(zhì)均勻分布在原始種質(zhì)范圍內(nèi),沒有重疊現(xiàn)象,說明核心種質(zhì)庫去除了冗余,具有良好的代表性。

圖1 核心種質(zhì)和原種質(zhì)的PCA分析Fig.1 PCA analysis of core germplasm and original germplasm

綜上,構(gòu)建完成的初級核心種質(zhì)共包含38份榕江茶種質(zhì)資源(表6),其5個評價指標VR、RPR、CR、MD、VD分別為113.90%、100%、100.00%、13.04%、13.04%,具有較高的遺傳多樣性指數(shù)和豐富的變異系數(shù)變化率,完整保留了原種質(zhì)的極差和全部性狀。榕江茶初級核心種質(zhì)的極差符合率(CR)大于80%,且均值差異百分率(MD)小于20%,完全滿足初級核心種質(zhì)的構(gòu)建指標[19]。

表6 榕江茶初級核心種質(zhì)名錄

3 討 論

核心種質(zhì)構(gòu)建的結(jié)果很大程度上取決于對構(gòu)建策略的選擇。核心種質(zhì)構(gòu)建策略主要包括取樣方法、取樣比例、評價方法等,因不同作物的遺傳構(gòu)成和遺傳分化不同,其代表性存在差異[23],應(yīng)篩選出適合每種作物自身特點的方法策略進行核心種質(zhì)的構(gòu)建。由于計算和分類討論的局限性,對構(gòu)建策略中的所有因素進行分析是十分繁瑣的。因此,本研究采用部分因素組合討論的方法,針對不同的遺傳距離、聚類方法和總體取樣規(guī)模相結(jié)合構(gòu)建榕江茶核心種質(zhì)。本研究采用固定的組內(nèi)取樣方法,在固定因素中,隨機取樣策略雖可以保持原種質(zhì)的遺傳多樣性形式,但隨機取樣是盡可能地獲得原種質(zhì)的無偏樣本,而無法保留原種質(zhì)有效的遺傳多樣性。而對數(shù)比例法在控制榕江茶種質(zhì)資源群體遺傳冗余度的同時,適當增加了稀有性狀的取樣數(shù)量。因此,本研究采用組內(nèi)對數(shù)取樣法的前提下進行后續(xù)分析,此方法已在辣椒(Capsicumspp.)[20]、切花小菊(Chrysanthemummorifolium)[21]等研究中取得了很好的應(yīng)用效果。

因不同的材料在取樣方式、生長環(huán)境和自身的遺傳多樣性等方面都存在一定差異。目前,總體取樣規(guī)模沒有統(tǒng)一的界定,多為原始種質(zhì)的5%～40%[25]。因此,總體取樣規(guī)模應(yīng)當根據(jù)作物種類,原種質(zhì)群體大小和群體組成具體分析。沈志軍等[25]認為部分木本植物雜交周期長,核心種質(zhì)要盡可能多地保留原種質(zhì)的表型,取樣比例要相應(yīng)提高。由于本研究的實驗材料數(shù)量較少,為了確保核心種質(zhì)取樣的合理性和系統(tǒng)性,設(shè)定10%為總體取樣規(guī)模的最低值。經(jīng)過綜合比較7種總體取樣規(guī)模后發(fā)現(xiàn),30%總體取樣規(guī)模的極差符合率均達100%,在此基礎(chǔ)上擁有最高的遺傳多樣性指數(shù)和較高的表型保留比例,變異系數(shù)變化率基本穩(wěn)定為108%～110%,綜合表現(xiàn)最好。目前最為常用的遺傳距離為馬氏距離和歐式距離。但由于協(xié)方差矩陣在小規(guī)模核心種質(zhì)構(gòu)建中的問題,馬氏距離并不適用于小規(guī)模核心種質(zhì)構(gòu)建[27]。本研究在構(gòu)建核心種質(zhì)時將性狀數(shù)據(jù)進行標準化進而排除不同量綱的影響,通過對比4種評價指標后,發(fā)現(xiàn)標準化歐氏距離構(gòu)建的榕江茶核心種質(zhì)總體指標優(yōu)于馬氏距離,進一步驗證了王建成[26]的觀點;并與切花小菊[21]、豌豆(PisumsativumL.)[27]、毛花獼猴桃(ActinidiaerianthaBenth.)[28]等植物的研究結(jié)果相似。不同的聚類方法將植物分為不同類別,進而影響核心種質(zhì)的代表性。李萌等[29]采用8種聚類方法構(gòu)建高粱地方品種核心種質(zhì),結(jié)果表明,最長距離法構(gòu)建效果優(yōu)于其他7種。郎彬彬等[28]研究結(jié)果表明,類平均法構(gòu)建毛花獼猴桃核心種質(zhì)的效果最佳。在多年生植物中,最短距離法對白樺[22]核心種質(zhì)構(gòu)建效果最好。本研究中針對4種聚類方法進行了討論,利用備選核心種質(zhì)的評價指標衡量不同聚類方法的優(yōu)劣,結(jié)果表明,采用最短距離法構(gòu)建的核心種質(zhì)在保持了原群體遺傳變異的同時,使個體間的差異達到了最大化,多樣性指數(shù)均值和變異系數(shù)變化率等方面優(yōu)于其他方法,是構(gòu)建榕江茶核心種質(zhì)的最佳聚類方法。

農(nóng)藝性狀是植株基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果,容易受環(huán)境影響,基于農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)構(gòu)建核心種質(zhì)庫具有一定的局限性[31]。目前,利用分子標記技術(shù)構(gòu)建核心種質(zhì)是研究熱點,如王倩等[31]利用高基元EST-SSR標記構(gòu)建了黍稷(PanicummiliaceumL.)核心種質(zhì)。童巧珍等[32]利用相關(guān)序列擴增多態(tài)性(SRAP)標記技術(shù)構(gòu)建了15份百合核心種質(zhì)。這些方法具有準確、高效、不受外界環(huán)境以及基因間互作影響等特點,能被很好地用來構(gòu)建核心種質(zhì)。因此,下一步將利用單核苷酸多態(tài)性(SNP)分子標記技術(shù)結(jié)合表型和生化品質(zhì)成分進一步構(gòu)建榕江茶核心種質(zhì),以期為有效利用其優(yōu)異基因提供理論依據(jù)。同時,對核心種質(zhì)、初級核心種質(zhì)、保留種質(zhì)等不同級別間的動態(tài)變化進行補充,提高核心種質(zhì)有效性和實用性。

4 結(jié) 論

利用23個農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)對榕江茶核心種質(zhì)進行構(gòu)建時,以標準化歐氏距離、最短距離法和30%的取樣規(guī)模結(jié)合進行逐步聚類是構(gòu)建榕江茶核心種質(zhì)的最適方法,最終得到38份核心種質(zhì),占原種質(zhì)32.20%。核心種質(zhì)能夠很好地代表原種質(zhì)的遺傳多樣性和遺傳變異,為榕江茶種質(zhì)資源的有效保存、利用奠定了理論基礎(chǔ)。