不同結香方法對土沉香木質部芳香物質形成的影響

龐圣江,周再知,李英健,張 培,李忠國,鄧碩坤

(1 中國林業科學研究院熱帶林業實驗中心,廣西憑祥 532600;2 南京林業大學,南京 210037;3 中國林業科學研究院熱帶林業研究所,廣州 510520,4 廣西大學,南寧 530004;5 廣西友誼關森林生態系統國家定位觀測研究站,廣西憑祥 532600;6 崇左憑祥友誼關森林生態系統廣西野外科學觀測站研究站,廣西憑祥 532600)

沉香是沉香屬樹種含有油脂的木質部分(俗稱“結香”),也是沉香屬樹種遭遇傷害、真菌侵擾等外界脅迫,產生含有芳香氣味用于抵御不良因素的次生代謝產物[1]。沉香具有極高的經濟價值,通常應用于高檔香料、名貴藥材、宗教用品和精細工藝雕刻用品;同時,沉香因其具有獨特而優異的香韻氣味,令人感覺愉悅舒適,在調節人體心理生理機能方面發揮著重要作用[2]。沉香主要由具有揮發性芳香物質組成,包括色酮類、萜烯類和芳香族類化合物[3-4]。健康的沉香屬樹種木質部呈白亮色,沉香有效成分少且香味不濃,香農通過利用打洞、砍傷和火燒等傳統結香的方法,才能形成少量沉香。人工沉香無論色澤形態、香氣活性成分均有別于天然沉香;采用不同的結香方法,沉香屬樹種結香木質部結構變化、沉香形成時間及其揮發性香氣成分亦有差異,潘質洪[5]研究認為激素處理有利于土沉香結香木質部變色面積擴大與芳香物質的積累;Liu等[6]研究表明鉆孔誘導土沉香結香,所結沉香品質相對稍好,但其產量低和結香時間長。一些諸如火燒可適當增加沉香產量[7-8],采用激素、無機鹽溶液混合處理,土沉香結香時間有所縮短且產量也相對較高[9-10],沉香品質仍然參差不齊。可見,盡管土沉香結香技術豐富多樣,還需要繼續積極創新和優化結香技術,才能實現生產量大質優的沉香,是人工種植土沉香的最終目的,也是沉香產業發展急需解決的一個重大難題。

土沉香(Aquilariasinensis)木質部的變色范圍作為沉香產量的重要指標,通常縱向變色距離較長而橫向寬度較窄,淀粉和可溶性糖含量變化,與具有芳香氣味的沉香物質形成密切相關[9,11];醇溶性提取物直接決定沉香四醇含量,后者是沉香藥材的優劣標志物,《中國藥典》規定其不低于0.1%作為藥用的質量指標[12];土沉香結香木質部中的芐基丙酮、愈創木醇和2-(2-苯乙基)色酮等主要特征香氣成分[13],也已被用作沉香品質評價的重要依據。

試驗以12年生土沉香人工林為研究對象,通過設置鉆孔、火燒孔和黃綠墨耳菌(Melanotusflavolivens)溶液誘導土沉香結香試驗,比較分析各處理的土沉香結香木質部變色范圍,淀粉和可溶性糖含量、醇溶性提取物、沉香四醇、揮發性香氣成分方面的差異,探討不同結香方法對土沉香木質部芳香物質形成的影響,為創新和優化土沉香結香技術提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗地位于廣西憑祥市熱帶林業實驗中心夏石樹木園附近的沉香種植基地(106°89′E,22°11′N)。研究地氣候條件為南亞熱帶季風氣候,年平均氣溫21～23 ℃,年平均降雨量1 060～1 780 mm,無霜期344～362 d,土壤為酸性紅壤土,為土沉香適宜栽培區。以12年生土沉香人工林為研究對象,選取長勢相對均勻,無嚴重病蟲害植株開展結香誘導處理。土沉香的平均胸徑(15.86±0.86) cm、平均樹高(7.78±0.26) m。

1.2 試驗方法

2021年8月以來,選擇晴朗天氣,在土沉香人工林試驗地內,設置鉆孔、火燒孔和黃綠墨耳菌溶液誘導處理,不處理作為對照組。采用完全隨機區組排列,每個區組各處理10株,3次重復,共計120株。鉆孔處理采用電鉆(鉆頭直徑10 mm),在土沉香樹體基部 0.5 m 處直至距離樹干的第一枝下高處0.5 m,上下洞口相距10 cm處,橫向排列鉆孔;火燒孔處理則是用直徑為12 mm的火燒鋼釬,鐵錘輔助往土沉香樹體鉆孔;1 L黃綠墨耳菌溶液用大樹營養液袋分裝2袋,以輸液方式注入土沉香樹體進行結香處理。2022年10月,即處理12個月后,每個處理隨機取樣5株,于土沉香樹體鉆孔上下1～3 cm處的鑿取適量結香木質部,取樣后用錫箔紙包好拿回實驗室自然晾干,粉碎研磨成細粉末。每次稱取過40目篩的沉香粉末,檢測相關指標。

1.2.1 土沉香木質部組織變色范圍

土沉香經過打孔、火燒孔和菌液一定時間處理,結香木質部有明顯的含油性沉香物質,且具有特殊的芳香氣味,淺色區(變色材)、深色區(沉香材)界限明顯,剝去樹皮和白邊材,可直接初步判別土沉香木質部變色情況(圖1)。取樣時,土沉香剝皮和用勾刀刨去外圍一部分白邊材,采用直尺和電子游標卡尺,分別測量淺色區、深色區的橫向寬度(處理孔為中心,沿左、右方向的寬度)、縱向長度(處理孔為中心,沿上、下方向的長度)[9,11]。

圖1 3種結香技術獲得的土沉香標本Fig.1 A. sinensis samples obtained from three agarwood-induction technique treatments

1.2.2 淀粉和可溶性糖含量

取樣前于土沉香鉆孔上方3.0～5.0 cm處鉆取結香木質部小木塊,錫箔紙包好放入液氮里速凍。當天將樣品帶回實驗室,用液氮磨成粉并置于-80 ℃溫冰箱臨時保存,蒽酮-硫酸比色法和硝酸鈣法測定淀粉和可溶性糖含量[9]。

1.2.3 醇溶性提取物測定

根據林業行業標準LY/T 2904—2017《沉香》方法[14],采用電子稱準確取2 g沉香粉末,用體積分數95%乙醇(色譜純)超聲波提取 2 h,靜置3～5 min后,過0.45 μm濾膜獲取懸浮液,重復提取3次,待液體揮發至恒重,稱其質量計算醇溶性提取物含量[15]。

1.2.4 沉香四醇和揮發性成分

按照1.2.3節操作步驟,每次提取10 mL乙醇提取物,溶劑揮發后用乙酸乙酯定容2 mL,過濾干燥后,在廣西大學林產品質量檢測中心采用GC-MS(日本島津),DB-5ht專用色譜柱(250 m×4.6 mm,5 μm),對待測樣品進行沉香四醇和揮發性成分測定。

沉香四醇:根據2020版《中華人民共和國藥典》測定沉香四醇含量,沉香四醇標準品濃度為30 μg/mL(由中國食品藥品檢定研究院提供),采用LC-20A液相色譜儀(日本島津),色譜柱:C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測沉香四醇含量。

揮發性成分:稱取2 g沉香粉末,按步驟1.2.3節的操作獲取乙醇提取物,進行GC-MS上機檢測揮發性成分。色譜條件:升溫程序,起始溫度90 ℃保持1 min后,以5 ℃/min升溫至150 ℃,保持5 min;再以 5 ℃/min 的升速至260 ℃,保持10 min。進樣口溫度250 ℃;載氣為高純He(99.999%),載氣流量0.5 mL/min,進樣量1 μL,溶劑延遲4 min。質譜條件:離子源接口溫度為250 ℃,電離方式 EI;電子能量70 eV,質量掃描范圍35～350 m/z。

利用 GC-MS Postrun Analysis軟件,根據色譜峰的保留指數和質譜碎片信息檢索 NIST 譜庫(2014),確認化學成分。采用沉香四醇的保留時間作為基準,對GC-MS總離子流圖和HPLC中的色譜峰進行保留時間校正,用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件,尋找共有峰并計算峰面積[16]。

1.3 數據處理

用SPSS 20.0對數據進行ANOVA方差分析,Duncan法進行多重比較,用Origin 2021繪圖。

2 結果與分析

2.1 土沉香木質部組織變色范圍

從表1可以看出,3種結香方法對土沉香結香木質部變色范圍的影響各異,對照組土沉香木質部未結香均為白邊材。從土沉香結香木質部變色大小范圍來看,黃綠墨耳菌溶液處理>火燒孔處理>鉆孔處理。

表1 土沉香木質部組織橫向和縱向變色范圍

其中,黃綠墨耳菌溶液處理土沉香木質部(沉香材部分)變色范圍最大,縱向變色距離最長達120.02 cm,橫向變色距離最寬達3.84 cm,離輸入孔越近深色區域范圍越大。鉆孔和火燒孔誘導土沉香木質部變色范圍,持續存在沒有規律性的變色材和沉香材;沉香材縱向變色距離均超過110 cm,但橫向變色距離最寬僅為0.58 cm和1.06 cm,而后者變色范圍優于前者處理。

2.2 土沉香木質部組織淀粉和可溶性糖含量

從圖2可以看出, 3種方法處理的土沉香結香木質部淀粉含量均顯著低于CK處理(P<0.05),降幅范圍為24.82%～55.25%;其中,黃綠墨耳菌溶液處理土沉香結香木質部淀粉含量降幅最大,火燒孔處理次之,鉆孔處理降幅最小。此外,黃綠墨耳菌溶液和火燒孔處理土沉香結香木質部可溶性糖含量均顯著高于CK處理(P<0.05),鉆孔處理與CK處理差異不顯著(P>0.05),三者漲幅范圍為23.76%～46.87%;其中,黃綠墨耳菌溶液處理土沉香結香木質部可溶性糖含量漲幅最大,火燒孔處理次之,鉆孔處理漲幅最小,說明不同結香方法處理后,土沉香結香木質部淀粉出現不同程度的消耗,促進了可溶性糖轉化積累,黃綠墨耳菌溶液處理效果最為明顯。

柱狀圖上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。圖2 土沉香木質部組織淀粉和可溶性糖含量Different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05). The same as below.Fig.2 Starch content and soluble sugar content of xylem tissue of A. sinensis

2.3 土沉香醇溶性提取物和沉香四醇含量

從圖3可以看出,鉆孔、火燒孔和黃綠墨耳菌溶液處理的土沉香樣品醇溶性提取物含量分別達到11.84%、13.26%和21.08%,均顯著高于對照處理(P<0.05)。各方法誘導處理的所有土沉香樣品醇提物含量在11.84%～21.08%之間,均達到林業行業標準LY/T 2904—2017《沉香》鑒定標準,但醇溶性提取物含量卻各有差異。其中,黃綠墨耳菌溶液處理效果最優,與其他處理均存在顯著差異(P<0.05);鉆孔和火燒孔處理的效果次之,二者之間的差異不顯著(P>0.05),說明黃綠墨耳菌溶液處理更有利于提高沉香醇溶性提取物含量。

圖3 土沉香木質部組織醇溶性提取物和沉香四醇含量Fig.3 The alcohol soluble extractive content and agarotetrol content of xylem tissue of A. sinensis

3種方法處理的沉香四醇含量分別達到0.18%、0.26%和0.42%,CK處理未檢測出沉香四醇。各誘導處理的所有沉香四醇含量在0.18%～0.42%之間,均超過2020年版《中國藥典》所規定的0.1%含量標準。根據沉香四醇含量高低順序依次為黃綠墨耳菌溶液處理>火燒孔處理>鉆孔處理,且各處理間存在顯著差異(P<0.05)。由此可見,黃綠墨耳菌溶液處理更有利于提高沉香四醇含量。

2.4 土沉香香氣揮發性成分

通過GC/MS方法分析結果發現,3種方法處理的土沉香結香木質部芳香物質形成過程中,共鑒定出46種主要揮發性香氣成分(表2)。

表2 結香誘導處理所得土沉香主要揮發性香氣成分

鉆孔處理土沉香芳香物質中共鑒定出29種成分,占總峰面積的66.79%;主要成分包括色酮及其衍生物(16.40%)、沉香螺醇(7.35%)、愈創木醇(6.34%)、香樹烯(5.49%)、芐基丙酮(5.47%)、二氫卡拉酮(5.28%)和枯蘇醇(3.59%)。火燒孔處理土沉香芳香物質中共鑒定出 33種成分, 占總峰面積的70.92%;主要成分是色酮及其衍生物(16.58%)、沉香螺醇(8.67%)、愈創木醇(7.45%)、二氫卡拉酮(5.52%)、香樹烯(5.24%)、枯蘇醇(4.26%)、芐基丙酮(4.23%)和α-檀香醇(3.05%)。黃綠墨耳菌溶液處理土沉香芳香物質中共鑒定出36種成分,占總峰面積的76.78%;主要成分是色酮及其衍生物(21.87%)、沉香螺醇(8.56%)、愈創木醇(8.32%)、芐基丙酮(6.82%)、二氫卡拉酮(3.06%)、香樹烯(2.83%)、枯蘇醇(2.82%)和壬醛(2.81%)。

3 討 論

本研究中鉆孔、火燒孔和黃綠墨耳菌溶液處理,對土沉香結香木質部變色范圍的影響各異;其中,以黃綠墨耳菌溶液處理的變色范圍最大,深色區(沉香材)縱向變色距離最長達120.02 cm,橫向變色距離最寬達3.84 cm。鉆孔或火燒孔的變色范圍較小,屬于沒有規律性的沉香材。這與其他方法的土沉香結香,出現類似心材變色現象有一定相似性[9,17],尤其是菌液處理之后通過蒸騰作用,向上輸導所引起土沉香樹體防御反應,更有利于木質部芳香物質的積累。有學者研究認為,有色物質大多數來源于含氧酚羥基或者碳基,這些助色自由基與土沉香結香木質部變色有密切關系,主要通過淀粉代謝經由可溶性糖類化合物轉化而來[18-19]。

本研究表明,3種方法處理土沉香結香木質部淀粉和可溶性糖含量(除鉆孔)均顯著低于CK處理(P<0.05)。其中,菌液處理的淀粉含量降幅最大,火燒孔處理次之,鉆孔處理降幅最小;可溶性糖含量在這些組織結構內增加,增幅則相反之。前人研究認為可能與人工誘導土沉香樹體所產生的生理響應有關[20-21],木質部淀粉加速轉化為可溶性糖,增強自身代謝能力,利于具有芳香氣味的物質形成以抵御外界脅迫。

3種方法處理土沉香的醇溶性提取物含量分別達到11.84%、13.26%和21.08%,顯著高于CK處理(P<0.05)。也高于半截干或接菌處理1年左右土沉香[22],通體結香技術處理為11.15%～24.02%[23],與本研究結果基本一致,說明不同方法處理土沉香的醇溶性提取物含量各有差異。3種方法處理的沉香四醇含量分別達到0.18%、0.26%和0.42%,這與其他人工促進土沉香結香,檢測的沉香四醇含量無明顯差別[24]。總體上來看,本研究3種方法處理1年后,沉香四醇含量均超過0.1%的藥用標準,這可能與土沉香結香的時間有關,積累時間越長沉香品質才更優質。

研究顯示,3種方法處理的土沉香結香木質部芳香物質主要是色酮及其衍生物(16.40%～21.87%)、沉香螺醇(7.35%～8.56%)、愈創木醇(6.34%～8.32%)、香樹烯(2.83%～5.49%)、芐基丙酮(4.23%～6.82%)、二氫卡拉酮(3.06%～5.52%)和枯蘇醇(2.82%～4.26%)。而采用生物接菌、火燒和化學刺激法誘導處理[25-27],所得沉香螺旋醇、沉香呋喃、白木香醛、芐基丙酮、對甲氧基芐基丙酮和矛蒼術醇是沉香主要芳香物質,與本研究結果有所差異。與2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、沉香螺醇、愈創木二烯-15-醛、二氫卡拉酮和雪松醇是馬來沉香(A.malaccensis)主要芳香物質也有一定區別[28-29]。可見,土沉香結香木質部芳香物質的化學成分及其相對含量方面的差異,可能與沉香屬樹種、結香方法、結香時長和遺傳因素存在密切關聯[30-31]。

土沉香結香木質部芳香物質中,色酮及其他衍生物、沉香螺醇、二氫卡拉酮和枯蘇醇帶有木質和堅果香氣,是最具有強烈的芳香活性成分之一。這與馬來沉香、近全緣沉香(A.subintegra)和柯拉斯那沉香(A.crassna) 揮發性香氣成分研究結果[32]相似,是土沉香芳香物質的重要成分。另外,一些諸如白木香醛、二氫沉香呋喃、雅欖酮、纈草烯醛、愈創木-4,11-二烯和α-布藜烯等低濃度香氣物質,也有助于提升沉香香韻氣味。3種方法處理土沉香所含的芐基丙酮、欖香素、4-苯基-2-丁酮、纈草-4,7(11)-二烯和香木蘭烷的香氣貢獻率也比較大,甜果香、花香和藥草香歸因于該類物質存在;壬醛、環氧異香橙烯、香樹烯、丁酸丁酯、4-叔丁基間二甲苯和間二甲苯是甜香的主要香氣來源,說明沉香香氣是不同揮發性成分的氣味物質之間的平衡。