滇水金鳳轉錄因子TT8的克隆及表達分析

李新藝,李 洋,向南星,李澤鳳,黃美娟,黃海泉

(西南林業大學 園林園藝學院,國家林業和草原局西南風景園林工程技術研究中心,云南省功能性花卉資源及產業化技術工程研究中心,西南林業大學 園林園藝花卉研發中心,昆明 650224)

植物絢麗多彩的顏色是決定植物觀賞價值的關鍵因素之一,其中花色占據了不可或缺的地位[1]。花色的相關研究具有十分深遠的意義,目前國內外對植物花色的研究主要集中在花色的形成調控和變異機理等方面[2-3],而對花色影響最直接的就是植物中花色苷的合成代謝[4]。

花色素苷代謝途徑中結構基因編碼合成各種相關酶,如4CL和DFR等[5],其上游的調節基因可調控上述結構基因的表達,如bHLH、MYB、WD40等[6],其中bHLH參與了植物的各種生命活動,如花色素苷的合成和生長發育等,還與植物對不良環境的響應調節有關[7-9]。TT8(TRANSPARENT TESTA 8)基因屬于bHLH家族的IIIf亞組,該亞組還包括GL3、EGL3和AtMYC1等基因,均與植物花青素的代謝有關[10]。

TT8能夠與TT2(MYB)、TTG1(WD40)蛋白形成穩定三元復合物調控花青素合成途徑中后期結構基因的表達,還能夠通過正負反饋調節自身的表達,進而促進花青素和原花青素的合成[11-12]。細莖石斛(Dendrobiumcandidum)DcTT8可以通過結合DcF3′H和DcUFGT的啟動子來調節它們的表達,進而影響花青素的生物合成[13]。在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中,MtTT8基因可以使擬南芥(Arabidopsisthaliana)Attt8突變體以及蒺藜苜蓿Mttt8突變體恢復花青素和原花青素的積累,且MtTT8可以和WD40家族的MtWD40-1以及MYB家族的MtPAR或MtLAP1相互作用來激活ANR和ANS的啟動子,進而分別調節原花青素和花青素的生物合成[14]。蓮(Nelumbonucifera)NnTT8基因是AtTT8的同源基因,可以恢復擬南芥tt8突變體表型,這表明NnTT8基因在調節花青素和原花青素生物合成方面具有與AtTT8相似的功能[15]。

在擬南芥tt8突變體中過表達臘梅(Chimonanthuspraecox)CpTT8基因能促進植株中花青素的積累,并使擬南芥突變體恢復表型,表明CpTT8基因可以正向調控臘梅中花青素的合成[16]。轉錄因子在植物花色調控方面的作用已成為研究熱點,隨著人們對不同物種花色的深入研究,bHLH在花青素調控方面的作用得到了科學驗證,但目前國內外鮮見鳳仙花bHLH的相關報道,TT8基因在鳳仙花中的功能和作用機制有待闡明。

滇水金鳳(ImpatiensuliginosaL.)是中國特有的鳳仙花屬植物,集中分布于中國西南地區,一年生或多年生。滇水金鳳具有花色豐富、開花期長、生物量大、觀賞性較高且抗性強等特點,所以其在滇池等濕地的建設中應用廣泛[17]。

本研究以RT-PCR技術克隆滇水金鳳中的TT8基因,生物信息學方法分析其序列結構特征以及系統發育等,并以本課題組在野外發現的野生型(紅色)及突變型(白色、粉色和深紅色)滇水金鳳花器官為植物材料,通過qRT-PCR檢測TT8基因在滇水金鳳4種花色以及4個花發育時期中的表達規律,為進一步研究花色調節相關轉錄因子IuTT8在滇水金鳳花色苷代謝途徑的調控機制以及花色變異機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

滇水金鳳4個花色均采自于昆明市撈魚河濕地公園。目的基因的克隆和qRT-PCR分別以紅色滇水金鳳以及4種花色及其4個花發育階段(S1花苞期、S2始花期、S3盛花期、S4謝花期)的滇水金鳳花器官為材料(圖1)。

圖1 滇水金鳳花器官的4種花色及其4個花發育時期Fig.1 Floral organs of four colors and their four flower development stages in I.uliginosa

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取與TT8基因克隆

滇水金鳳總RNA以OMEGA公司的RNA提取試劑盒提取,然后以全式金公司的逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA,并置于-20 ℃中備用。

根據轉錄組數據設計IuTT8的特異性引物,將其分成3段進行克隆,IuTT81F(5′-ATGGCGGCGCCTCCTAGCTT-3′)、IuTT81R(5′-GCCAA-ACTCAACCACACCATCC-3′);IuTT82F(5′-AGCAAGCTCTTCACTAGAGC-3′)、IuTT82R (5′-CTTCTTCGTCGTCAACATCC-3′);IuTT83F(5′-CTTCTCTCCCTGCCTTGTAC-3′)、IuTT83R(5′-TTAACATTGTGGTATTATTCTG-3′),共2 136 bp。以紅色滇水金鳳花器官為模板進行IuTT8基因的cDNA和gDNA擴增。PCR反應程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 50 s,61 ℃(IuTT81)/55 ℃(IuTT82)/51 ℃(IuTT83)30 s,72 ℃ 2 min,35次循環;72 ℃ 10 min。連接轉化后進行菌檢,將電泳條帶正確的送往生工測序,結果用DNAMAN 6.0進行序列拼接。

1.2.2IuTT8基因生物信息學分析

使用Gene Structure Display Server分析IuTT8基因的結構;用ExPasy對IuTT8進行基本理化性質分析;分別以SignalP-4.1與TMHMM Server預測IuTT8的信號肽與跨膜結構;PSORTⅡ預測IuTT8的亞細胞定位;IuTT8的二、三級結構分別以SOPMA和Swiss-Model預測;CDD預測IuTT8蛋白的保守結構域;MEME預測IuTT8及其同源蛋白的基序,并以TB Tool進行蛋白基序可視化。DNAMAN 6.0用于序列比對;MEGA 7.0用于構建系統發育樹。

1.2.3IuTT8基因的表達特性分析

IuTT8基因的qRT-PCR引物:qIuTT8F(5′-GCTGGAAGAAACCTGAAGAG-3′)、qIuTT8R(5′-CTAAACGACCGATGGTAATTC-3′);內參基因為Actin[17]。每個樣品重復3次,使用2-ΔΔCT計算4種花色及其4個花發育時期中IuTT8基因的相對表達量,用SPSS進行數據顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 滇水金鳳IuTT8基因的克隆

通過克隆獲得IuTT8基因的最大開放閱讀框和gDNA,其最大開放閱讀框為2 136 bp,其gDNA全長為3 938 bp,共6個內含子,分別長613 bp(105～717 bp)、802 bp(988～1 789 bp)、107 bp(1 887～1 993 bp)、106 bp(2 009～2 114 bp)、93 bp(2 172～2 264 bp)、81 bp(3 779～3 859 bp),見圖2和圖3。

M. DL 2000 Marker; 1. IuTT8-1; 2. IuTT8-2;3. IuTT8-3; g1. IuTT8-1 gDNA;g2. IuTT8-2 gDNA; g3. IuTT8-3 gDNA.圖2 滇水金鳳TT8基因的克隆Fig.2 Cloning of TT8 from I.uliginosa

圖3 滇水金鳳IuTT8基因的基因結構分析Fig.3 Gene structure analysis of IuTT8 gene in I. uliginosa

2.2 IuTT8蛋白的基本理化性質及保守域分析

IuTT8基因全長為2 136 bp,編碼711個氨基酸。IuTT8蛋白的相對分子量為79 249.06 D;pI為5.17;分子式為C3459H5500N980O1104S24;原子總數為11 067;不穩定指數(instability index)為65.03,為不穩定蛋白質;IuTT8的GRAVY為-0.509,是親水性蛋白。

預測表明IuTT8不存在信號肽與跨膜區(圖4)。PSORT Ⅱ 預測結果表明,IuTT8蛋白主要(56.5%)定位在細胞核中。

圖4 滇水金鳳IuTT8蛋白的信號肽(A)及跨膜區(B)預測Fig.4 The signal peptide (A) and transmembrane region (B) prediction of IuTT8 protein in I. uliginosa

圖5 IuTT8蛋白三級結構Fig.5 The tertiary structure of IuTT8 protein

二級結構預測發現IuTT8蛋白主要包含了51.2%無規則卷曲,還有36.57%的α-螺旋以及少量的延伸鏈(9.14%)和β-轉角(3.09%)等結構。上述預測結果表明 IuTT8蛋白的穩定性不高,且此蛋白無規則卷曲結構占比大,其結構可能比較復雜。運用Swiss-Model,以擬南芥TT8蛋白為模型,預測滇水金鳳IuTT8的三級結構,其QMEAN值為0.46,GMQE值為0.41,預測結果表明IuTT8蛋白三級結構以無規則卷曲與α-螺旋為主(圖 5),結果與二級結構預測的一致。

2.3 IuTT8蛋白保守域和Motif預測

結構域分析表明IuTT8蛋白具有2個保守的區域,其中1個是N端的MYB互作區;另1個是C末端的HLH區,該區在其他物種中除了可以與自身形成同型二聚體外,還能夠與其他蛋白質一起形成異型二聚體。由圖6可知IuTT8蛋白含有bHLH超家族的特征蛋白序列,具有DNA binding site和dimer interface區域,因此推測滇水金鳳IuTT8蛋白屬于bHLH超家族成員(圖6)。

圖6 滇水金鳳IuTT8蛋白的保守結構域分析Fig.6 Conserved domains analysis of IuTT8 protein in I. uliginosa

通過MEME進行IuTT8及其同源蛋白的基序預測,分別命名為motif1～motif10,分析發現TT8氨基酸的保守序列分析呈現相似性,且都含有10種保守基序,其中motif 6、motif 3、motif 1和motif 5位于MYB互作區,motif 2位于保守的DNA binding site和dimer interface區域。除此之外,滇水金鳳、喜馬拉雅鳳仙花(I.glandulifera)和山茶(Camelliasinensisvar.assamica)的TT8蛋白還含有1個重復的motif 7(圖7)。

圖7 IuTT8及其同源氨基酸序列的motif預測Fig.7 Motif prediction of IuTT8 and its homologous amino acid sequence

2.4 IuTT8蛋白序列比對與系統進化分析

以BLAST和DNAMAN等對滇水金鳳IuTT8進行氨基酸序列比對分析,結果表明其與同屬植物喜馬拉雅鳳仙花的相似性最高(86.34%),與其他植物也具有較高的相似性,約60%,如獼猴桃科的中國獼猴桃(Actinidiachinensis,QAT77714.1)等。此外,IuTT8具有bHLH家族典型的Basic-HelixⅠ-Loop-HelixⅡ保守結構域,該結構域包含DNA結合位點和二聚體區域,并且源自不同物種的TT8氨基酸序列在該區域的保守性高(圖8)。運用NJ(neighbor-joining)法,Bootstrap值設為1 000,以JTT+G模型構建IuTT8及其同源氨基酸序列的系統發育樹,發現IuTT8與同屬植物喜馬拉雅鳳仙花的聚為一支,同時與杜鵑花目的柿(Diospyroskaki)、獼猴桃(Actinidiachinensisvar.chinensis)、山茶(Camelliasinensisvar.assamica)等植物的同源蛋白聚成大支(圖9)。

劃線部分為Basic-HelixⅠ-Loop-HelixⅡ保守結構域。圖8 滇水金鳳IuTT8蛋白的同源氨基酸序列比對The lined sections are Basic-HelixⅠ-Loop-HelixⅡ conservative domains.Fig.8 Alignment analysis of homologous amino acid sequence of IuTT8 protein in I. uliginosa

圖9 IuTT8及其同源氨基酸序列的系統發育樹(NJ法)Fig.9 Phylogenetic tree of IuTT8 and its homologous amino acid sequence(NJ method)

2.5 IuTT8基因的表達分析

IuTT8基因的表達特性分析見圖10,分析發現IuTT8在深紅色花中的表達量要顯著高于其他花色,其次是紅色、粉色和白色滇水金鳳。IuTT8基因在白色花中的表達量無顯著變化;在粉色、紅色和深紅色滇水金鳳中IuTT8基因的表達量先上升,并在S3時期升到了最高,與其他3個花發育時期差異顯著,而后減少,其中以深紅色S3階段表達量最高。隨著滇水金鳳花發育的進行,IuTT8基因的表達量在除白色外的滇水金鳳中均呈先升后降的趨勢,且IuTT8基因的表達量隨著滇水金鳳花色的加深而增加,紅色和深紅色S3的表達量分別約為白色S2階段的14,48倍,這在一定程度上表明滇水金鳳的花色與IuTT8基因的表達量呈正相關(圖10)。

S1.花苞期;S2.始花期;S3.盛花期;S4.謝花期。不同小寫字母表示時期之間差異顯著(P<0.05)。圖10 滇水金鳳4種花色及其4個花發育時期中IuTT8基因的表達特性分析S1. Bud stage; S2. Beginning flowering stage; S3. Blooming stage;S4. Withering stage. Different lowercase letters indicate significant difference among stages (P<0.05).Fig.10 Analysis of the expression characteristics of IuTT8 during the four flower development periods and the four color variations of I. uliginosa

3 討 論

bHLH轉錄因子主要參與植物的類黃酮、生物堿、萜類化合物及其他生物代謝合成的調控[18-20]。IuTT8基因gDNA為3 938 bp,含有6個內含子,擬南芥和甘藍型油菜(Brassicanapus)中的TT8基因gDNA長度分別為4 643 bp和2 949 bp,并且都具備6個內含子[21];擬南芥的第5個內含子長達1 684 bp,但甘藍型油菜的第5內含子僅為252 bp,其最長的第2內含子也只有399 bp;滇水金鳳的第5內含子長93 bp,其最長的第2內含子長802 bp,這說明不同植物其TT8基因的內含子進化程度可能不同。

IuTT8蛋白具有與其他物種TT8類似的bHLH家族所特有的結構域,包括位于N末端可以與DNA活性位點結合的保守結構功能域,以及位于C末端的HLH保守區域,獼猴桃(Actinidiachinensiscv. ‘Hongyang’)[22]和扁桃(Prunusdulciscv. ‘Texas’)[23]等TT8蛋白均包括這個功能保守結構域,推測IuTT8蛋白屬于bHLH家族。通過不同物種TT8蛋白Motif基序預測發現,IuTT8具有與其他物種相似的基序,這進一步證明本研究所克隆片段為滇水金鳳中的TT8基因。bHLH的C端可形成同型或異型二聚體,但是IuTT8在滇水金鳳中是以同源還是異源二聚體的形式發揮作用還有待進一步的驗證,IuTT8是否與MYB和WD40蛋白存在相互作用也需要進一步研究。系統進化樹結果顯示IuTT8與同屬植物喜馬拉雅鳳仙花的親緣關系最近,聚在一支,這與相似性分析的結果一致。與其聚在同一支的AcbHLH42可以調節中華獼猴桃內果皮中花青素的生物合成,其主要通過AcMYB123和AcbHLH42的共表達激活AcF3GT1和AcANS或同源基因的轉錄,進而調控花青素的合成[21];滇水金鳳IuTT8基因可能與之具有相似的功能,在花青素合成中起作用。另有研究表明雙子葉植物花青素合成過程中的早期結構基因是由MYB基因控制的,晚期結構基因是由MBW復合物控制的,如在過表達紫花椰菜(Purplecauliflower)BoTT8基因的煙草花器官中只有晚期結構基因表現出上調[24];擬南芥AtTT8基因也可以控制花青素代謝途徑中晚期結構基因的表達[25];在滇水金鳳中TT8基因是否存在通過調控晚期結構基因的表達進而影響花青素合成的機制,還需要進一步驗證。

對4種花色及4個時期滇水金鳳花器官中的IuTT8基因進行qRT-PCR分析發現,IuTT8的表達量隨著滇水金鳳花色的加深而逐漸升高,且隨著花發育時期的進行呈先升后降的趨勢,推測IuTT8基因與滇水金鳳花色的正調控相關,在滇水金鳳花青素合成中發揮重要作用,但還需要進行更深入的研究,以了解IuTT8基因在滇水金鳳中的具體功能和調控機制。

4 結 論

該研究從滇水金鳳中克隆了bHLH家族的轉錄因子IuTT8,并分析了其在不同花色中的表達規律,初步驗證了IuTT8的表達量與花色呈正相關,在滇水金鳳花色的形成中發揮重要作用,但是否與其他蛋白存在相互作用以及是否能夠對晚期結構基因進行調節還需要深入研究。